本文關(guān)鍵詞：賴氨酸特異性去甲基化酶1在卵巢癌細胞增殖和凋亡中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的:賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1,LSD1)是2004年發(fā)現(xiàn)的一種黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinulcleotide,FAD)依賴性胺氧化酶,它能通過氧化反應(yīng)生成甲醛而特異性去除組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)和第9位賴氨酸(H3K9)的甲基化修飾,調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活與抑制,發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。最近的研究顯示LSD1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及遷移侵襲中扮演重要的角色。目前已有研究報道LSD1在卵巢癌組織和細胞株中高度表達,而與卵巢癌細胞增殖關(guān)系尚不明確。因此,本研究以卵巢癌細胞HO8910為研究對象,探索LSD1基因過表達、敲低及其酶活性抑制對HO8910細胞增殖、周期和凋亡的影響,以及對細胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)作用。方法:1.利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定干擾LSD1的卵巢癌HO8910細胞株,首先合成特異性針對LSD1基因的shRNA,插入pLKO-Tet-On載體,構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒p LKO-Tet-On-shLSD1;然后將pLKO-Tet-On-shLSD1、pHR’-CMV-8.2ΔVPR和pHR’-CMV-VSVG三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine2000包裝產(chǎn)生慢病毒;再將攜帶有LSD1-shRNA的慢病毒感染HO8910細胞,采用嘌呤霉素篩選LSD1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)入的HO8910細胞。2.構(gòu)建穩(wěn)定過表達LSD1的卵巢癌細胞株,首先用Lipofectamine2000將pLVX-Tet-On、pHR’-CMV-8.2ΔVPR及pHR’-CMV-VSVG三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集病毒上清感染HO8910細胞,采用G418篩選細胞得到穩(wěn)定的HO8910-rtTA細胞;再用包含p LVX-tight-puro-LSD1的慢病毒顆粒感染HO8910-rtTA細胞,用嘌呤霉素篩選細胞得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達LSD1細胞株。3.用實時定量RT-PCR和Western blot法分別檢測LSD1干擾(LSD1-knockdown,LSD1-KD)和過表達(LSD1-overexpression,LSD1-OE)的HO8910細胞中LSD1 mRNA和蛋白的表達及其底物H3K4me2表達水平。4.利用不同濃度(0、25、50、100μmol/L)LSD1特異性抑制劑tranylcypromine(TCP)處理HO8910細胞,采用MTT法和EdU DNA標記法檢測細胞的增殖;在LSD1-KD和LSD1-OE HO8910細胞中,加入不同濃度(0、1、10、100 ng/m L)doxycycline(Dox)誘導(dǎo)LSD1敲低或過表達后,檢測細胞增殖的變化。5.采用Annexin V/PI和流式細胞儀分別檢測上述不同處理組中細胞凋亡和細胞周期的變化。6.利用Western blot法檢測不同處理組細胞中P21、Bax、Bcl-2和Survivin蛋白的表達水平。結(jié)果:成功建立了穩(wěn)定干擾LSD1和過表達LSD1的卵巢癌HO8910細胞株;干擾LSD1基因表達或抑制LSD1酶活性,能夠顯著抑制HO8910細胞的增殖和促進細胞的凋亡(P㩳0.05);而LSD1過量表達,則顯著促進HO8910細胞的增殖及抑制細胞的凋亡。此外,LSD1表達下調(diào)誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G1期,并下調(diào)促存活蛋白Bcl-2和Survivin的表達,以及上調(diào)促凋亡蛋白P21和Bax表達;相反,外源性表達LSD1能夠促進HO8910細胞G1/S期轉(zhuǎn)化,并上調(diào)Bcl-2和Survivin蛋白的表達水平,以及下調(diào)P21和Bax蛋白的表達。結(jié)論:抑制及干擾人卵巢癌HO8910細胞的LSD1能有效抑制細胞的生長和增殖,使細胞阻滯在G1期,促進細胞凋亡;而外源性表達LSD1能夠增強細胞的增殖,促進細胞G1/S期轉(zhuǎn)化,抑制細胞的凋亡。我們的研究結(jié)果提示,LSD1可能是卵巢癌治療新的靶點。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 LSD1 細胞增殖 細胞凋亡 基因表達
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 主要英文縮寫與名詞對照13-15
• 第一章 前言15-25
• 1.1 卵巢癌15-16
• 1.1.1 卵巢癌流行趨勢15
• 1.1.2 卵巢癌中的表觀遺傳修飾15-16
• 1.2 LSD116-22
• 1.2.1 LSD1基本結(jié)構(gòu)16-17
• 1.2.2 LSD1催化機理17-18
• 1.2.3 LSD1的調(diào)控18-19
• 1.2.4 LSD1與腫瘤的關(guān)系19-22
• 1.3 研究內(nèi)容22-25
• 1.3.1 研究目的和意義22
• 1.3.2 實驗設(shè)計思路22-25
• 第二章 建立LSD1穩(wěn)定表達的卵巢癌細胞株25-45
• 2.1 實驗儀器和材料25-30
• 2.1.1 實驗儀器25-26
• 2.1.2 主要耗材26
• 2.1.3 主要試劑26-27
• 2.1.4 配制的試劑27-30
• 2.2 實驗方法30-40
• 2.2.1 293T細胞及H08910細胞的復(fù)蘇、傳代及凍存30-31
• 2.2.2 藥物濃度篩選31
• 2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定干擾LSD1的卵巢癌HO8910細胞株31-33
• 2.2.4 構(gòu)建穩(wěn)定過表達LSD1的卵巢癌HO8910細胞株33-34
• 2.2.5 Western blot法檢測LSD1蛋白的表達34-36
• 2.2.6 定量RT-PCR檢測LSD1 mRNA的表達36-38
• 2.2.7 穩(wěn)定誘導(dǎo)的細胞H3K4me2的表達水平38-40
• 2.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析40
• 2.3 結(jié)果40-43
• 2.3.1 成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾LSD1的卵巢癌HO8910細胞株40-41
• 2.3.2 成功構(gòu)建過表達LSD1的卵巢癌細胞HO8910細胞株41-42
• 2.3.3 改變LSD1表達對H3K4me2表達的影響42-43
• 2.4 討論43-45
• 第三章 LSD1對卵巢癌細胞增殖的影響45-56
• 3.1 實驗儀器和材料45-46
• 3.1.1 實驗儀器45
• 3.1.2 主要耗材45
• 3.1.3 主要試劑45
• 3.1.4 配置的試劑45-46
• 3.2 實驗方法46-49
• 3.2.1 卵巢癌細胞培養(yǎng)及保存46-47
• 3.2.2 MTT法檢測細胞增殖47
• 3.2.3 Cell-LightTM EdUTP TUNEL (EdU) 染色法47-48
• 3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析48-49
• 3.3 結(jié)果49-54
• 3.3.1 MTT實驗結(jié)果49-51
• 3.3.2 EdU實驗結(jié)果51-54
• 3.4 討論54-56
• 第四章 LSD1對卵巢癌細胞周期的影響56-61
• 4.1 實驗儀器和材料56
• 4.1.1 實驗儀器56
• 4.1.2 主要耗材56
• 4.1.3 主要試劑56
• 4.1.4 配置的試劑56
• 4.2 實驗方法56-58
• 4.2.1 檢測原理56-57
• 4.2.2 碘化丙啶（PI）單染色法步驟57-58
• 4.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析58
• 4.3 結(jié)果58-60
• 4.4 討論60-61
• 第五章 LSD1對卵巢癌細胞凋亡的影響61-67
• 5.1 實驗儀器和材料材料61
• 5.1.1 實驗儀器61
• 5.1.2 主要耗材61
• 5.1.3 主要試劑61
• 5.1.4 配制的試劑61
• 5.2 實驗方法61-63
• 5.2.1 檢測原理61-62
• 5.2.2 實驗步驟62-63
• 5.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析63
• 5.3 結(jié)果63-66
• 5.4 討論66-67
• 第六章 LSD1對增殖和凋亡相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)67-72
• 6.1 實驗儀器和材料67
• 6.1.1 實驗儀器67
• 6.1.2 主要耗材67
• 6.1.3 主要試劑67
• 6.2 實驗方法67-68
• 6.2.1 細胞培養(yǎng)及加藥處理67
• 6.2.2 免疫印跡法（Western Blot）檢測LSD1對增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達67-68
• 6.3 結(jié)果68-70
• 6.4 討論70-72
• 第七章 總結(jié)和展望72-74
• 參考文獻74-81
• 致謝81-82
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果82
• 發(fā)表的論文82
• 參加的課題82

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