本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞自噬在宮頸癌細(xì)胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:宮頸癌是婦科腫瘤中常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于乳腺癌,是威脅女性生命健康的第二大惡性腫瘤。近年來的臨床數(shù)據(jù)顯示,宮頸癌的發(fā)病有年輕化發(fā)展的趨勢(shì),且晚期宮頸癌治愈難、易復(fù)發(fā),然而目前的治療手段毒副作用大,因此亟需尋找有效的宮頸癌治療手段。在可用于宮頸癌治療的化療藥物中,鹽酸吡柔比星為第三代蒽環(huán)類抗腫瘤藥物。臨床試驗(yàn)證明,鹽酸吡柔比星還可用于膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌等多種實(shí)體腫瘤的治療,治療過程中引起的免疫抑制、胃腸道刺激等毒副作用均較順鉑等化療藥物小,具有良好的臨床應(yīng)用前景。但宮頸癌的臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大部分宮頸癌患者對(duì)鹽酸吡柔比星的治療不敏感。因此,探討宮頸癌細(xì)胞抵抗鹽酸吡柔比星的相關(guān)機(jī)制,尋找相應(yīng)增敏措施,將有助于宮頸癌的臨床治療。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞在遭受外界生存環(huán)境壓力時(shí)啟動(dòng)的通過降解自身物質(zhì)并利用降解產(chǎn)物而補(bǔ)充細(xì)胞存活需求的過程。越來越多的研究表明,無論是腫瘤細(xì)胞本身對(duì)化療的不敏感,還是后天化療過程中獲得的治療抵抗,細(xì)胞自噬均發(fā)揮了重要作用。研究表明,細(xì)胞自噬在膀胱癌、乳腺癌等對(duì)鹽酸吡柔比星及其同類藥物的治療抵抗中發(fā)揮重要作用,提示細(xì)胞自噬可能是宮頸癌細(xì)胞對(duì)鹽酸吡柔比星治療不敏感的重要機(jī)制。因此,本研究的目的在于探討細(xì)胞自噬在宮頸癌細(xì)胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及其分子機(jī)制,從而為設(shè)計(jì)針對(duì)性的增敏策略提供依據(jù)。研究?jī)?nèi)容及研究方法:第一部分細(xì)胞自噬促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)鹽酸吡柔比星治療抵抗1.驗(yàn)證鹽酸吡柔比星對(duì)宮頸癌細(xì)胞存活及死亡的影響。2.確定鹽酸吡柔比星對(duì)自噬的誘導(dǎo)作用。3.通過聯(lián)合使用自噬抑制劑,確定細(xì)胞自噬在鹽酸吡柔比星殺傷宮頸癌細(xì)胞中的作用。第二部分miR34c-5p/ATG4B通路在宮頸癌細(xì)胞中介導(dǎo)了鹽酸吡柔比星誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng)1.經(jīng)鹽酸吡柔比星處理后,分別在m RNA水平及蛋白水平篩選宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)變化最明顯的自噬相關(guān)分子,并結(jié)合基因沉默技術(shù)評(píng)估其對(duì)鹽酸吡柔比星所誘導(dǎo)細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響,以確定該分子在這一過程中的作用。2.通過雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定鹽酸吡柔比星對(duì)ATG4B基因轉(zhuǎn)錄活性的影響;通過RNA半衰期實(shí)驗(yàn)確定鹽酸吡柔比星對(duì)ATG4B m RNA穩(wěn)定性的影響。3.分析并篩選靶向ATG4B的micro RNAs,通過RNA半衰期實(shí)驗(yàn)確定其在鹽酸吡柔比星穩(wěn)定ATG4B m RNA過程中發(fā)揮的作用,通過雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)該micro RNA與ATG4B m RNA間作用的方式及靶點(diǎn)。4.驗(yàn)證miR34c-5p介導(dǎo)的ATG4B下調(diào)在鹽酸吡柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞存活過程中的作用。5.移植瘤實(shí)驗(yàn)體內(nèi)檢測(cè)鹽酸吡柔比星對(duì)miR34c-5p及ATG4B表達(dá)的影響。第三部分miR34/ATG4B信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過程中的普遍意義1.驗(yàn)證表柔比星及多柔比星是否誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng),以及靶向抑制miR34c-5p或ATG4B能否增敏藥物的殺細(xì)胞效果。2.檢測(cè)雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)中ATG4B、miR34的變化,以及靶向miR34、ATG4B對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)是否有影響。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,主要用到的研究方法有:1.宮頸癌細(xì)胞系C33A、Si Ha、He La細(xì)胞及卵巢癌SKOV3的體外培養(yǎng)及傳代。2.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況。3.臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的死亡率。4.流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。5.Real-time PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中m RNA、蛋白的表達(dá)變化。6.分子克隆技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒。7.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)量的改變。8.熒光顯微鏡下觀察自噬小點(diǎn)陽性細(xì)胞率的改變,確定自噬水平的變化。9.雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)目的基因5'端或3'端活性的改變。10.RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因m RNA穩(wěn)定性的改變。11.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)鹽酸吡柔比星對(duì)在體宮頸癌的影響。結(jié)果:1.鹽酸吡柔比星在誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)還誘導(dǎo)了保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng),這是導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞對(duì)鹽酸吡柔比星不敏感的重要機(jī)制。2.在宮頸癌細(xì)胞中,自噬相關(guān)分子ATG4B介導(dǎo)了鹽酸吡柔比星誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng)。3.在鹽酸吡柔比星誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng)中,ATG4B上調(diào)是由于其自身m RNA穩(wěn)定性的增強(qiáng),而不是轉(zhuǎn)錄活性的增加。4.miR34a及miR34c-5p均可靶向ATG4B m RNA的3′非翻譯區(qū)而調(diào)節(jié)ATG4B的表達(dá)水平,但在鹽酸吡柔比星處理的宮頸癌細(xì)胞中,僅miR34c-5p發(fā)揮作用。5.miR34c-5p/ATG4B信號(hào)通路在宮頸癌細(xì)胞中介導(dǎo)了鹽酸吡柔比星誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng)。6.移植瘤小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)鹽酸吡柔比星對(duì)在體宮頸癌細(xì)胞同樣可以誘導(dǎo)miR34c-5p/ATG4B/自噬信號(hào)機(jī)制的發(fā)生。7.miR34/ATG4B信號(hào)通路對(duì)于自噬水平的調(diào)節(jié)具有普遍意義。結(jié)論:在宮頸癌細(xì)胞中,鹽酸吡柔比星通過下調(diào)miR34c-5p,導(dǎo)致其對(duì)ATG4B m RNA的降解減少從而上調(diào)了ATG4B的表達(dá),增強(qiáng)了自噬反應(yīng)。增強(qiáng)的自噬反應(yīng)對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用,從而導(dǎo)致了宮頸癌細(xì)胞對(duì)鹽酸吡柔比星治療的不敏感。靶向miR34c-5p或ATG4B均可增敏鹽酸吡柔比星對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用。miR34/ATG4B信號(hào)通路對(duì)于自噬水平的調(diào)節(jié)具有普遍意義。
【關(guān)鍵詞】：ATG4B 細(xì)胞自噬 宮頸癌 鹽酸吡柔比星 miR34c-5p
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 細(xì)胞自噬促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)鹽酸吡柔比星治療抵抗13-26
• 2.1 材料與方法13-20
• 2.2 結(jié)果20-23
• 2.3 討論23-25
• 2.4 結(jié)論25-26
• 第三章 miR34c-5p/ATG4B通路在宮頸癌細(xì)胞中介導(dǎo)了鹽酸吡柔比星誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞自噬反應(yīng)26-51
• 3.1 材料與方法27-42
• 3.2 結(jié)果42-48
• 3.3 討論48-50
• 3.4 結(jié)論50-51
• 第四章 miR34/ATG4B信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過程中的普遍意義51-60
• 4.1 材料與方法52-54
• 4.2 結(jié)果54-58
• 4.3 討論58-59
• 4.4 結(jié)論59-60
• 全文結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-66
• 文獻(xiàn)綜述 細(xì)胞自噬在腫瘤治療方面的研究進(jìn)展66-74
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況74-75
• 致謝75

【相似文獻(xiàn)】

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1 楊蕾;黃紅兵;陳倩超;劉韜;王人英;;鹽酸吡柔比星在不同注射液中的穩(wěn)定性考察[J];今日藥學(xué);2009年06期

2 張淑芳;胡喜鋼;曹漫明;汪森明;;葉酸-葡聚糖-鹽酸吡柔比星偶聯(lián)物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的靶向作用[J];山西醫(yī)藥雜志;2007年03期

3 張婧;賀江虹;董雅璐;王勇強(qiáng);張積仁;;預(yù)設(shè)靶標(biāo)免疫靶向鹽酸吡柔比星治療小鼠S180肉瘤的試驗(yàn)研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2009年20期

4 ;[J];;年期

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1 吳亞冉;細(xì)胞自噬在宮頸癌細(xì)胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞自噬在宮頸癌細(xì)胞抵抗鹽酸吡柔比星中的作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：358935