本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)、微血管密度及子宮內(nèi)膜血流評估子宮內(nèi)膜容受性的價(jià)值，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:隨著輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART)日新月異的進(jìn)展,試管嬰兒的成功率由20%~30%增加至50%左右。能夠使胚胎成功著床,起到重要作用的是子宮內(nèi)膜的容受性和胚胎質(zhì)量。在均j移植優(yōu)質(zhì)胚胎的基礎(chǔ)上,建立良好的內(nèi)膜容受性是該生理過程的重要環(huán)節(jié)。子宮內(nèi)膜容受性與調(diào)節(jié)內(nèi)膜血管的因子存在極密切的關(guān)系,與內(nèi)膜的血液供應(yīng)息息相關(guān)。促血管生成相關(guān)因子能夠通過調(diào)節(jié)血管功能等方面,改善血液供應(yīng)。在許多與血管生成相關(guān)的因子中,我們選擇內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric Oxide Synthase eNOS)進(jìn)行研究。eNOS作為一種將L精氨酸和氧氣催化成一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的生物蛋白酶,對調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部血供方面起著重要的作用[1]。它催化形成的產(chǎn)物-NO,是一種重要的多功能因子,能夠調(diào)節(jié)血管阻力,參與細(xì)胞損傷修復(fù)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等,進(jìn)而介導(dǎo)許多生理功能,發(fā)揮生物作用。eNOS在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部血液供應(yīng),影響子宮內(nèi)膜容受性。血管生成可以通過微血管密度(Microvessel Density MVD)這一指標(biāo)來評價(jià)。微血管的特點(diǎn)是其內(nèi)皮細(xì)胞能夠經(jīng)過CD34抗體標(biāo)記并被染色,利用這一特性,我們可以觀察微血管的生成情況[2]。當(dāng)組織中微血管被標(biāo)記的越多時(shí),也預(yù)示著此處新生的毛細(xì)血管數(shù)量越大,代表該處的血液供應(yīng)更豐富。血流的供應(yīng)可以通過彩色多普勒超聲監(jiān)測血流參數(shù)如搏動(dòng)指數(shù)(pulsatility,PI)、阻力指數(shù)(resistance index,RI)及收縮期與舒張期血流速度比值(systolic/diastolic,S/D)來體現(xiàn)。所以子宮內(nèi)膜著床窗口期eNOS表達(dá)、微血管密度及子宮內(nèi)膜血流組成一系列評價(jià)體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transferm,IVF-ET)子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)。方法:納入2014年8月~2015年6月初次在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受IVF助孕治療的患者。納入正常月經(jīng)周期,年齡20-35歲,單純?yōu)檩斅压芤蛩匦蠭VF助孕者共計(jì)60例。收集著床窗口期子宮內(nèi)膜,使用免疫組織化學(xué)技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測eNOS、MVD的表達(dá)。1子宮內(nèi)膜采集:收集行控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)前的自然月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜。首先由特定人員監(jiān)測卵泡,并用半定量試紙測定尿促黃體生成素。當(dāng)尿LH≥20 IU/L時(shí),肌注絨促性素,并記錄內(nèi)膜厚度及形態(tài),當(dāng)卵泡消失或體積明顯縮小為排卵[3]。排卵后6~7天,使用GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀檢測子宮內(nèi)膜血流灌注、測定子宮內(nèi)膜形態(tài)及血流參數(shù)RI、PI、S/D值等。由專人操作,連續(xù)測量3次并計(jì)算平均值。利用一次性內(nèi)膜取樣器采集著床窗口期內(nèi)膜。一部分于-80℃保存,一部分存放于甲醛固定液中,取內(nèi)膜后均無陰道異常出血。2控制性卵巢刺激:排卵后6~7天給予注射用醋酸亮丙瑞林緩釋微球(Gonadotrophin-releasing-hormone agonist,Gn RH-a,中國博恩特)1.4mg,14天后達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn),使用重組人促卵泡激素α(Gonal-F,r-FSH,果納芬,默克雪蘭諾)150-225IU啟動(dòng),利用超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜和卵泡生長情況,并結(jié)合雌二醇(Estradiol,E2)等性激素的變化判斷,當(dāng)至少有2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑大于20 mm時(shí),當(dāng)晚注射艾澤(重組人絨促性素α,默克雪蘭諾)250μg,艾澤注射后36-37h取卵,適時(shí)向培養(yǎng)皿中加入精子,行IVF受精,進(jìn)行胚胎培養(yǎng),將培養(yǎng)3天的胚胎植入子宮,均移植優(yōu)質(zhì)胚胎2枚,移植后28天B超見到孕囊即診斷為臨床妊娠。再根據(jù)臨床妊娠與否分為妊娠組與非妊娠組。其中妊娠組(n=30例),未妊娠組(n=30例)。3 RT-PCR:測定子宮內(nèi)膜中eNOS mRNA的表達(dá)。首先提取總RNA。加入Tri Quick總RNA提取試劑,將子宮內(nèi)膜組織放在冰盒上研磨,各取實(shí)驗(yàn)組和對照組等量子宮內(nèi)膜組織,并加入Rezol 1 ml,放置于勻漿器內(nèi)充分勻漿,提取總RNA,再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段長度為340bp,同時(shí)以擴(kuò)增內(nèi)參照片段長度為605bp的GAPDH。PCR循環(huán)條件為:PCR擴(kuò)增條件:95℃10 min 1循環(huán),(94℃45 s,54℃30 s,72℃50 s)35個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min,4℃保溫。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠,行電泳后,利用gel-proanalysis3.1圖像分析系統(tǒng),進(jìn)行圖像分析及照相。利用內(nèi)參值校正IOD值,將校正后的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4免疫組化檢測:使用4%甲醛固定子宮內(nèi)膜后進(jìn)行石蠟包埋,制成約4μm厚連續(xù)性組織切片。分別進(jìn)行HE和SP法免疫組化染色。經(jīng)過脫蠟、高壓熱抗原修復(fù)、封閉、加入多克隆兔抗人eNOS(稀釋濃度為1:100)、加入二抗、利用DAB染料進(jìn)行顯色、再利用蘇木素染料重新染色、經(jīng)過酒精脫水后變透明、再用中性樹膠進(jìn)行封片。利用PBS作為陰性對照代替一抗。顯微鏡觀察并拍照。MVD判斷標(biāo)準(zhǔn)使用兔抗人CD34染色,稀釋濃度為1∶100,采用免疫組化SP法,余步驟同前。依據(jù)Weidner判斷標(biāo)準(zhǔn),計(jì)數(shù)MVD。5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用((?)±s)表示,組間差異采用t檢驗(yàn);等級資料利用秩和檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)P0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩變量相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析,當(dāng)P0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 IVF妊娠組(n=30)及未妊娠組(n=30)年齡、不育年限、b FSH(基礎(chǔ)促卵泡生成素)、BMI(體重指數(shù))、Gn天數(shù),Gn用量、獲卵數(shù)等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 IVF妊娠組子宮內(nèi)膜著床窗口期eNOSmRNA的表達(dá)明顯高于未妊娠組,eNOSmRNA妊娠組的表達(dá)為(0.72±0.21),對照組的表達(dá)(0.29±0.12),兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3 eNOS在妊娠組及未妊娠組腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。IVF妊娠組(n=30),“-”表達(dá)1例,“+“表達(dá)5例,“++”表達(dá)12例,“+++”表達(dá)12例。IVF未妊娠組(n=30),“-”表達(dá)12例,“+”表達(dá)14例,“++”表達(dá)2例,“+++”表達(dá)2例,p0.05,比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4 MVD計(jì)數(shù)妊娠組計(jì)數(shù)14.53±3.28,未妊娠組12.20±3.83,P0.05,兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5 eNOS的表達(dá)與MVD的相關(guān)性分析經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析,子宮內(nèi)膜eNOS表達(dá)水平與MVD計(jì)數(shù)水平呈正相關(guān)(r=0.814,P0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6妊娠組子宮內(nèi)膜血流搏動(dòng)指數(shù)PI、阻力指數(shù)RI、S/D比值均低于非妊娠組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。妊娠組內(nèi)膜血流較未妊娠組豐富。結(jié)論:1妊娠組著床窗口期eNOSmRNA及蛋白的表達(dá)升高,證實(shí)了eNOS有助于提高子宮內(nèi)膜容受性,增加IVF胚胎著床機(jī)會(huì),為子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子之一。2妊娠組MVD計(jì)數(shù)增加,證實(shí)了MVD增加有助于提高子宮內(nèi)膜容受性;3 eNOS組化評分與MVD計(jì)數(shù)具有正相關(guān)性,推斷eNOS與子宮內(nèi)膜血流的形成密切相關(guān)。4妊娠組子宮內(nèi)膜PI、RI、S/D低于非妊娠組,血液供應(yīng)也較未妊娠組豐富。得出血流豐富程度與妊娠結(jié)局息息相關(guān)
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)皮型一氧化氮合酶 微血管密度 內(nèi)膜血流 子宮內(nèi)膜容受性 體外受精-胚胎移植
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-15
• 前言15-16
• 材料和方法16-25
• 結(jié)果25-26
• 附圖26-31
• 附表31-33
• 討論33-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 綜述 內(nèi)皮型一氧化氮合酶在生殖方面的研究進(jìn)展43-52
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 致謝52-53
• 個(gè)人簡歷53

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)、微血管密度及子宮內(nèi)膜血流評估子宮內(nèi)膜容受性的價(jià)值，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：341488