本文關(guān)鍵詞：過表達LCN-2卵巢癌細胞系的構(gòu)建及影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：卵巢癌在婦科的惡性腫瘤中病死率極高,是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,嚴重威脅著女性健康。雖然診斷方法仍在不斷的改進,但是卵巢癌的易復發(fā)及伴隨出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移和多重耐藥性,嚴重影響到卵巢癌的冶療效果。由于在患病早期無特異性癥狀,缺乏有效的早期診斷措施,大部分患者確診時已多處于晚期,讓患者錯過了最佳的治療時機。為了能夠做到早診斷早治療,在早期有一些腫瘤抗原標記物,例如經(jīng)典的CA125、CA199等,對于不同類型、不同部位的腫瘤大多伴有不同程度的變化。特別是一些腫瘤標記物隨著惡性程度的增加有相應規(guī)律的變化,雖不具有普遍性,但已經(jīng)對卵巢癌的早期診斷、治療及手術(shù)預后療效的改善給予了極大的參考意見。脂質(zhì)運載蛋白-2(lipocalin-2, LCN-2),是分泌型糖蛋白,又命名為中性粒細胞明膠相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin, NGAL),屬于脂質(zhì)運載蛋白家族的第2號成員。研究發(fā)現(xiàn),LCN-2的上凋與多種人類腫瘤相關(guān),包括肝癌,乳腺癌,子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。然而,LCN-2在腫瘤細胞中的生物學作用還不是很清楚。本研究通過過表達LC-2的方法來檢測其對卵巢癌細胞增殖的影響,探討LCN-2在卵巢癌中的表達和發(fā)展規(guī)律,為進一步研究LCN-2在卵巢癌細胞中的作用機制提供信息平臺,以及為治療卵巢癌提供更多有價值的信息。方法：Western Blot分析檢測四種細胞系中(CAOV3, ES2, OVCAR3, SKOV3)LCN-2蛋白水平上的表達；瞬時轉(zhuǎn)染LCN-2質(zhì)粒后通過WesternBlot分析檢測過表達LCN-2在卵巢癌細胞ES2中的蛋白表達；進行G418篩選,探測未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的ES2細胞的生存臨界濃度；采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法觀察過表達LCN-2在卵巢癌細胞中的生長狀況,通過G418的篩選建立穩(wěn)定過表達LCN-2的ES2細胞系；MTT細胞增殖試驗檢測過表達LCN-2對卵巢癌細胞增殖的影響。結(jié)果：KOV3) LCN-2表達情況,CAOV3(?)OVCAR3王高表達,ES2未表達,SKOV3較低表達Western B lot檢測這四種卵巢癌細胞系LCN-2表達情況,CAOV3和OVCAR3明顯表達,ES2未表達,SKOV3無明顯表達。常規(guī)細胞培養(yǎng)后,鏡下觀察四種細胞系的生長狀態(tài),CAOV3和OVCAR3細胞形態(tài)大多為菱形和多邊形上皮樣細胞狀,ES2細胞形態(tài)呈橢圓形,SKOV3呈梭狀上皮樣細胞形態(tài)。2構(gòu)建pcDNA3.1/mycHis-LCN-2質(zhì)粒DNA后,采用瞬時轉(zhuǎn)染法,驗證質(zhì)粒及LCN-2抗體的可用性首先我們用實驗室已有的空載體pcDNA3.1/mycHis-LACZ 和PEGFP-N3,分別構(gòu)建了pcDNA3.1/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2重組質(zhì)粒DNA。因LCN-2在ES2細胞中不表達,所以選擇ES2做瞬時轉(zhuǎn)染,pcDNA3.1/mycHis-LCN-2, PEGFPN3-LCN-2作為實驗組；pcDNA3.1/mycHi-s-LACZ, PEGFPN3作為對照組,24小時后全部收獲,Western Blot分析檢測轉(zhuǎn)染LCN-2的實驗組均明顯過表達,充分可以說明LCN-2質(zhì)粒構(gòu)建成功,抗體結(jié)合良好。3 G418藥物濃度檢測ES2產(chǎn)生耐藥的生長臨界濃度是700μg/m1。G418藥物濃度梯度(200μg/ml,400μg/ml,600μg/ml,900μg/ml, 1200μg/ml,1500μg/ml)置于六孔板中,觀察7天后發(fā)現(xiàn)ES2產(chǎn)生耐藥的生長臨界濃度為700μg/ml。4成功構(gòu)建LCN-2穩(wěn)定過表達的ES2細胞系瞬時轉(zhuǎn)染的預實驗成功后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES2細胞系,用700μg/ml G418進行篩選,約兩周后克隆形成。選擇生長狀態(tài)良好的細胞團進行增殖,收獲后Western Blot分析檢測發(fā)現(xiàn)LCN-2在#2,#3,#12,#14,#21,#22,#23和#31細胞株中的表達相對于V1,V2,V3和V7中明顯升高。Western Blot再次分析驗證了LCN-2在#2,#3,#31和#23中的穩(wěn)定過表達,并鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ES2細胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LCN2后的ES2形態(tài)無明顯變化。5 MTT細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)LCN-2有促進卵巢癌細胞增殖的作用我們選取穩(wěn)定過表達LCN-2的#2和#3的兩個細胞株作為實驗組；空載體V1和V2的細胞株作為對照組,經(jīng)過6天的連續(xù)檢測,LCN-2過表達組,相對于對照組,細胞的增殖速度明顯加快,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：1成功構(gòu)建了pcDNA/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2表達載體。2 LCN-2在卵巢癌細胞系中的表達差異,對于研究LCN-2在卵巢癌中的作用具有重要的價值。3 LCN-2的抗體與抗原結(jié)合良好,抗體效價較高。4構(gòu)建的LCN-2穩(wěn)定過表達的細胞系為以后進一步研究LCN-2在卵巢癌中的生物學作用打下基礎(chǔ)。5過表達LCN-2對卵巢癌細胞的增殖有促進作用。
【關(guān)鍵詞】：LCN-2 卵巢癌細胞 細胞增殖 ES-2細胞
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-11
• 材料與方法11-21
• 結(jié)果21-25
• 附圖25-29
• 附表29-30
• 討論30-31
• 結(jié)論31
• 參考文獻31-33
• 綜述 LCN-2 在人類腫瘤中的研究進展33-40
• 參考文獻36-40
• 致謝40-41
• 個人簡歷41

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本文編號：330633