發(fā)布時(shí)間：2021-07-04 01:01

　　目的研究人乳頭瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型的E6病毒癌基因被特異性靶向HPV16-E6位點(diǎn)成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）定點(diǎn)敲除后,宮頸癌細(xì)胞系SiHa在細(xì)胞凋亡和增殖方面的變化。方法設(shè)計(jì)靶向HPV16E6基因的向?qū)NA（guide RNA,gRNA）,脂質(zhì)體介導(dǎo)gRNA質(zhì)粒和Cas9質(zhì)粒對(duì)HPV16陽(yáng)性人宮頸癌細(xì)胞系SiHa和HPV16陰性的正常人胚腎上皮HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SiHa和HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞在凋亡率方面的變化;CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后兩種細(xì)胞的增殖能力變化;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)E6基因敲除后,SiHa細(xì)胞中E6蛋白和p53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果將靶向HPV16E6基因的gRNA質(zhì)粒和Cas9質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48h后,E6-gRNA/Cas9組SiHa細(xì)胞凋亡率為25.6%,與未轉(zhuǎn)染gRNA和Cas9質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞空白組（2%）以及只轉(zhuǎn)染等量Cas9質(zhì)粒的Cas9組（3%）相... 

【文章來源】：中華腫瘤防治雜志. 2015,22(18)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

圖１靶向ＨＰＶ１６－Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ作用模式

ｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）底物顯色，采集圖像，對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。１．４統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ軟件繪制圖表。數(shù)據(jù)以ｘ－±ｓ表示。采用ＳＰＳＳ１５．０進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)分析后，總體服從正態(tài)分布，且總體方差齊。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用ＬＳＤ法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝０．０５。２結(jié)果２．１ＣＲＩＳＰＲ對(duì)Ｅ６基因的作用作用于ＨＰＶ１６Ｅ６基因特定位點(diǎn)的ＣＲＩＳＰＲ造成Ｅ６基因相應(yīng)位點(diǎn)ＤＮＡ雙鏈斷裂的情況見圖２。由于靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ能夠介導(dǎo)識(shí)別特定位點(diǎn)雙鏈ＤＮＡ斷裂，而機(jī)體細(xì)胞在修復(fù)雙鏈切口的過程中產(chǎn)生隨機(jī)突變，Ｔ７Ｅ１酶可以識(shí)別突變位點(diǎn)，因此通過Ｔ７Ｅ１酶切鑒定ＣＲＩＳＰＲ在Ｅ６基因位點(diǎn)上產(chǎn)生ＤＳＢ的效率。圖２示，將Ｔ７Ｅ１酶切回收后的ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行１０％ＴＢＥ凝膠電泳，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組顯示３條帶：５００ｂｐ的ＰＣＲ產(chǎn)物條帶、２００和３００ｂｐ處的酶切產(chǎn)物條帶，而Ｃａｓ９組和空白組只顯示５００ｂｐ處的ＰＣＲ產(chǎn)物條帶，表明Ｔ７核酸酶特異識(shí)別ＤＮＡ錯(cuò)配位點(diǎn)并產(chǎn)生了切割。注：Ｍ．５００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．空白組；２．Ｃａｓ９組；３．Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組圖２Ｔ７Ｅ１酶切分析ＳｉＨａ細(xì)胞ＨＰＶ１６Ｅ６基因雙鏈ＤＮＡ斷裂情況２．２ＣＲＩＳＰＲ對(duì)ＳｉＨａ細(xì)胞凋亡的影響靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ可以促進(jìn)ＳｉＨａ細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染４８ｈ后，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組凋亡率達(dá)到２５．６％，Ｃａｓ９組和空白組ＳｉＨａ細(xì)胞凋亡率分別為３％和２％。轉(zhuǎn)染４８ｈ后，與Ｃａｓ９組和空白組

白組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ｐ＝０．４２２。而ＨＥＫ２９３細(xì)胞的Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組、Ｃａｓ９組和空白組在４９０ｎｍ處的細(xì)胞增殖抑制率無明顯變化，細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ｆ＝０．２１９，Ｐ＝０．８１０。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ只對(duì)ＨＰＶ１６陽(yáng)性的ＳｉＨａ細(xì)胞起作用，能夠抑制ＨＰＶ１６陽(yáng)性ＳｉＨａ細(xì)胞增殖，而對(duì)ＨＰＶ１６陰性的ＨＥＫ２９３細(xì)胞沒有增殖抑制作用。注：Ａ．ＣＲＩＳＰＲ轉(zhuǎn)染ＳｉＨａ細(xì)胞；Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ轉(zhuǎn)染ＨＥＫ２９３細(xì)胞圖３流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染靶向ＨＰＶ１６－Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ后ＳｉＨａ細(xì)胞和ＨＥＫ２９３細(xì)胞凋亡的情況２．４轉(zhuǎn)染ＣＲＩＳＰＲ對(duì)ＳｉＨａ細(xì)胞Ｅ６和ｐ５３蛋白表達(dá)影響轉(zhuǎn)染４８ｈ后，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組、Ｃａｓ９組和空白組Ｅ６與ｐ５３蛋白表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，各組內(nèi)參蛋白β－ａｃｔｉｎ的條帶亮度接近，而Ｅ６和ｐ５３條帶亮度差異明顯�？瞻捉M、Ｃａｓ９組和Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組Ｅ６蛋白表達(dá)相對(duì)含量分別為（９５．４４±０．７９）％、（８８．５５±０．７１）％和（５０．２０±０．６２）％。Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組與空白組和Ｃａｓ９組相比，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組Ｅ６蛋白表達(dá)明顯降低，Ｅ６蛋白抑制率為－４５．２４％，Ｆ＝３０．３９２，Ｐ＜０．００１（圖５）�？瞻捉M、Ｃａｓ９組和Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９組ｐ５３蛋白表達(dá)相對(duì)含量分別為（１００．２８±０．７３）％、（１５０．６６±０．８０）％和（３５０．３６±０．７７）％。與空白組相比，ｐ５３蛋白表達(dá)增加＋２

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰島素受體底物1（Irs1）基因[J]. 馬元武,馬婧,路迎冬,陳煒,張旭,于磊,張連峰.  中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志. 2014(03)
[2]HPV16E7 siRNA表達(dá)載體抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞E7基因的研究[J]. 王丹青,彭芝蘭,周慧梅,李大可.  中華腫瘤防治雜志. 2007(13)



本文編號(hào)：3263707