本文關(guān)鍵詞：基于二代測序技術(shù)的MEN 2A全基因組測序分析和6個(gè)EPPK家系的基因突變譜及產(chǎn)前DNA診斷研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：(1)2型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤(MEN2)是一種以甲狀腺、腎上腺髓質(zhì)和甲狀旁腺內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)生增生或腫瘤為主要特征的腫瘤,一般呈常染色體顯性遺傳。MEN2可分為3種亞型：2A型(MEN2A)、家族性甲狀腺髓樣癌型(FMTC)和2B型(MEN2B)。原癌基因RET是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一與MEN2發(fā)病相關(guān)的基因。其中,第634位氨基酸的點(diǎn)突變占MEN2A的800%～90%,又以p.Cys634Arg癥狀最為嚴(yán)重；(2)表皮松解性掌跖角化癥(EPPK)是相對常見的致殘性常染色體顯性遺傳性皮膚病,迄今無有效的臨床治療手段。本病主要由角蛋白KRT9基因的突變造成,外顯率100%；少數(shù)患者由KRT1基因突變引起。 目的：(1)利用全基因組測序技術(shù)(WGS)在基因突變篩查中的高效性和全面性優(yōu)勢綜合分析MEN2A疾病形成的分子病因,探究RET基因內(nèi)含子、可變剪接區(qū)等的變異是否與MEN2A的發(fā)生、臨床癥狀、腫瘤轉(zhuǎn)移以及發(fā)病年齡有關(guān)；(2)繪制本研究所收集到的EPPK家系基因突變譜,分析EPPK表型與致病基因KRT9基因型之間的相關(guān)性。順應(yīng)相關(guān)患者和親屬的強(qiáng)烈要求,在明確致病基因突變后,對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前DNA診斷。 方法：(1)收集了1個(gè)MEN2A家系(11例家族成員),對先證者進(jìn)行全基因組測序。過濾dbSNP、1000Genome Project和HapMap等數(shù)據(jù)庫,選取其中1個(gè)內(nèi)含子的InDel進(jìn)行亞克隆測序驗(yàn)證。通過PCR-DNA測序?qū)蚁?1例成員進(jìn)行RET進(jìn)行RET基因20個(gè)外顯子的突變驗(yàn)證和多態(tài)性篩查。(2)收集了6個(gè)EPPK家系。通過PCR-DNA測序及AS-PCR.微衛(wèi)星DNA多態(tài)性連鎖分析,篩查和驗(yàn)證相關(guān)KRT9和KRT1基因的突變。繼而,對4個(gè)EPPK家系的高風(fēng)險(xiǎn)患病胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前DNA診斷。 結(jié)果：(1)通過對先證者的WGS數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn),其RET基因第11號(hào)外顯子存在c.1900TC(p.Cys634Arg)突變。通過Sanger DNA測序法對MEN2A家系11例成員進(jìn)行篩查驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Ⅱ：1、Ⅱ：7和Ⅲ：4存在該位點(diǎn)突變,證實(shí)了WGS技術(shù)的精確性和高效性。亞克隆測序驗(yàn)證了Ⅱ：1和Ⅱ：7存在RET第2外顯子區(qū)上游71bp處(第43595836核苷酸位點(diǎn),內(nèi)含子區(qū))的InDel;(2)在本研究所涉及的6個(gè)EPPK家系或散發(fā)病例中存在3種KRT9雜合突變,分別為2個(gè)c.487CT(p.Arg163Trp)突變家系,1個(gè)c.488GA(p.Arg163G1n)突變家系,2個(gè)c.482AG(p.Asn161Ser)突變家系；1個(gè)EPPK家系患者未發(fā)現(xiàn)任何KRT9或KRT1突變。利用羊水基因組DNA-PCR-Sanger DNA測序法,成功地完成了4例產(chǎn)前DNA診斷,其中2例為正常胎兒,2例為致病基因突變攜帶胎兒。 結(jié)論：(1)在國際上首次將全基因組測序技術(shù)用于MEN2A的研究。在RET基因第2外顯子區(qū)上游71bp處(第43595836核苷酸位點(diǎn),內(nèi)含子區(qū))發(fā)生的InDel突變,可能對mRNA的剪接造成影響,使其拼接異常,不能編碼正常的氨基酸序列,從而可能對疾病產(chǎn)生一定的影響；(2)目前,開展基于KRT9基因突變檢測的產(chǎn)前DNA診斷,對于EPPK的預(yù)防至關(guān)重要。KRT9突變型與EPPK表型之間可能存在復(fù)雜的相關(guān)性,遺傳異質(zhì)性可能受環(huán)境因素、多態(tài)性核苷酸位點(diǎn)或修飾基因等未知因素的影響。
【關(guān)鍵詞】：2A型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤 RET 全基因組測序 突變 InDel 剪接 表皮松解性掌跖角化癥 KRT9 產(chǎn)前DNA診斷
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.5
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 英文縮略詞10-15
• 第一部分 基于二代測序技術(shù)的MEN 2A全基因組測序分析15-57
• 1 引言15-30
• 1.1 2型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤及其分子遺傳學(xué)研究15-20
• 1.1.1 多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤及其分型15-18
• 1.1.2 RET基因與受體18
• 1.1.3 RET原癌基因突變18-20
• 1.2 全基因組測序技術(shù)20-26
• 1.2.1 第二代測序技術(shù)的發(fā)展20-22
• 1.2.2 基于二代測序技術(shù)的全基因組測序技術(shù)流程22-23
• 1.2.3 基于二代測序技術(shù)的數(shù)據(jù)分析的工具23-25
• 1.2.4 基于二代測序技術(shù)的WGS的優(yōu)勢和局限性25-26
• 1.3 MEN 2的治療方案26-30
• 1.3.1 甲狀腺全切除術(shù)26-27
• 1.3.2 頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)27-28
• 1.3.3 MEN 2的遺傳咨詢28-30
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-37
• 2.1 主要溶液和試劑30
• 2.2 主要儀器30-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法31-37
• 2.3.1 MEN 2A家系的收集和組織病理學(xué)檢查31-32
• 2.3.2 基因組DNA的純化32-33
• 2.3.3 基于二代測序技術(shù)的MEN 2A全基因組測序(WGS)33-34
• 2.3.4 PCR擴(kuò)增相關(guān)目的基因編碼區(qū)34-36
• 2.3.5 Sanger DNA測序驗(yàn)證36
• 2.3.6 亞克隆測序驗(yàn)證36-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-46
• 3.1 MEN2A的全基因組測序37-41
• 3.1.1 WGS的質(zhì)量37-38
• 3.1.2 WGS所發(fā)現(xiàn)的突變38-41
• 3.2 MEN 2A家系成員RET基因突變篩查的電泳圖譜41-42
• 3.3 正、反向Sanger DNA測序的驗(yàn)證42-46
• 3.4 亞克隆測序(內(nèi)含子區(qū)第43595836核苷酸位點(diǎn)InDel的驗(yàn)證結(jié)果)46
• 4 討論46-50
• 5 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 第二部分 6個(gè)EPPK家系的基因突變譜及產(chǎn)前DNA診斷研究57-88
• 1 表皮松解性掌跖角化癥(EPPK)概述57-63
• 1.1 掌跖角化癥和表皮松解性掌跖角化癥(EPPK)57-58
• 1.2 EPPK的致病基因58-60
• 1.3 角蛋白60-61
• 1.4 EPPK的產(chǎn)前DNA診斷61-63
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法63-70
• 2.1 EPPK家系的收集63-66
• 2.2 基因組DNA的純化和PCR擴(kuò)增66-68
• 2.3 Sanger DNA測序68
• 2.4 AS-PCR驗(yàn)證基因突變68
• 2.5 EPPK高風(fēng)險(xiǎn)胎兒基因組DNA的純化68-69
• 2.6 胎兒DNA樣本的KRT9突變分析(包括微衛(wèi)星DNA多態(tài)性連鎖分析)69-70
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果70-81
• 3.1 Sanger DNA測序的結(jié)果70-72
• 3.2 AS-PCR驗(yàn)證基因突的變結(jié)果72-74
• 3.3 產(chǎn)前DNA診斷的結(jié)果74-81
• 3.3.1 Sanger DNA測序的結(jié)果74-76
• 3.3.2 胎兒的AS-PCR電泳結(jié)果76-78
• 3.3.3 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性連鎖分析的結(jié)果78-80
• 3.3.4 產(chǎn)前DNA診斷篩查出的正常胎兒出生后的手、足照片80-81
• 4 討論81-84
• 5 結(jié)論84-85
• 參考文獻(xiàn)85-88
• 綜述88-99
• 參考文獻(xiàn)96-99
• 個(gè)人簡介及碩士學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文99

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 戚曉平;應(yīng)榮彪;杜振方;張咸寧;馬炬明;;2型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2010年12期

  本文關(guān)鍵詞：基于二代測序技術(shù)的MEN 2A全基因組測序分析和6個(gè)EPPK家系的基因突變譜及產(chǎn)前DNA診斷研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：321037