本文關鍵詞：人子宮內(nèi)膜腺癌來源間充質(zhì)干細胞的分離鑒定及生物學特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:分離培養(yǎng)并鑒定子宮內(nèi)膜腺癌組織來源間充質(zhì)干細胞(Endometrial adenocarcinoma derived Mesenchymal Stem Cells,ECMSCs),比較其與正常子宮內(nèi)膜組織來源的間充質(zhì)干細胞(Endometrium derived Mesenchymal Stem Cells,EMSCs)的生物學特性差異,為研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制、侵襲轉(zhuǎn)移及對腫瘤微環(huán)境的影響提供理論與實驗依據(jù)。方法:1.無菌條件下獲取子宮內(nèi)膜腺癌組織,經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后種植于培養(yǎng)瓶中,用含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),采用組織貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs,0.25%胰酶消化傳代,同時取正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs做對照培養(yǎng)。顯微觀察子宮內(nèi)膜腺癌和正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs細胞形態(tài),瑞氏-姬姆薩染色觀察細胞核質(zhì),CCK8法檢測細胞生長曲線,流式細胞儀檢測細胞表型及細胞周期。誘導MSCs向脂肪、成骨細胞分化,通過油紅O染色檢測成脂誘導分化能力,堿性磷酸酶染色及Von Kossa染色檢測成骨誘導分化能力,并提取總RNA進行RT-PCR檢測相關成脂成骨轉(zhuǎn)錄因子的相對表達量變化。2.對分離鑒定得到子宮內(nèi)膜腺癌及正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs進行免疫調(diào)節(jié)能力的檢測,通過淋巴母細胞轉(zhuǎn)化實驗(Lymphocyte transformation test,LTT)和混合淋巴細胞反應實驗(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)檢測MSCs抑制T細胞增殖的免疫調(diào)節(jié)能力。并通過RT-PCR技術檢測兩種MSCs的免疫相關因子IL-6、IL-10、VEGF和TGF-β1的表達差異性。結(jié)果:1.從子宮內(nèi)膜腺癌組織中可培養(yǎng)出貼壁生長的成纖維樣的細胞,細胞形態(tài)呈長梭狀,旋渦狀和放射狀排布,原代生長緩慢,經(jīng)α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代后生長迅速,凍存復蘇后仍保持較強的增殖能力;經(jīng)CCK8法檢測細胞增殖情況,繪制子宮內(nèi)膜腺癌來源MSCs的細胞生長曲線,細胞呈“S”型曲線生長;流式細胞儀檢測細胞周期,可見80%左右細胞分布在G0/G1期,檢測相關細胞標記物,細胞表達CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC,不表達CD14、CD34、CD45、CD31、HLA-DR,提示分離得到的細胞符合MSCs的干細胞特征;此分離得到的細胞可經(jīng)誘導成脂肪細胞,油紅O染色可見有大量脂滴出現(xiàn),RT-PCR檢測可見脂肪分化關鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ2的顯著表達;經(jīng)成骨誘導14天,可見堿性磷酸酶染色陽性,誘導28天Von-Kossa染色可見鈣化骨結(jié)節(jié)形成;RT-PCR檢測可見成骨關鍵轉(zhuǎn)錄因子Osteocalcin的表達,說明從子宮內(nèi)膜腺癌組織中成功分離得到MSCs。2.對從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離得到的MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能進行檢測。LTT結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs能有效抑制經(jīng)由Con A刺激的T淋巴細胞增殖,且隨著MSCs數(shù)量的增加,其抑制能力逐漸增強,呈現(xiàn)劑量依賴效應;與之相近,MLR結(jié)果證實MSCs也可抑制異體淋巴細胞作為抗原刺激T細胞增殖的過程,且伴隨MSCs用量增加,其抑制作用更顯著。通過RT-PCR檢測MSCs中各免疫因子表達情況,發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs中IL-10、VEGF、TGF-β1的表達高于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),IL-6差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1.從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離培養(yǎng)出MSCs,子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs和正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs形態(tài)主要以長梭形為主,呈旋渦狀生長排布。2.子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs表達CD73、CD90、CDCD105、CD166、HLA-ABC,不表達CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR,細胞周期及細胞表面標記物符合干細胞特征。3.子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs具有分化成脂肪及成骨細胞的能力,其成脂分化能力強于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.體外LTT和MLR實驗結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs及正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs均具有低免疫源性和免疫調(diào)節(jié)功能,子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs對于T淋巴細胞增殖的抑制作用強于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs,可能與子宮內(nèi)膜腺癌腫瘤生長微環(huán)境及腫瘤細胞免疫逃逸相關。5.子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs相關細胞免疫因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表達高于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),可能與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展相關。
【關鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 子宮內(nèi)膜腺癌 生物學特性 免疫調(diào)節(jié)功能
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 材料及方法15-28
• 結(jié)果28-44
• 討論44-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-57
• 附錄：個人簡歷57-58
• 致謝58-59
• 綜述59-66
• 參考文獻63-66

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本文編號：299923