發(fā)布時(shí)間：2017-04-05 08:18

  本文關(guān)鍵詞：食蟹猴超數(shù)排卵及shank3基因敲除胚胎初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自閉癥也稱為孤獨(dú)癥,是由于神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)而導(dǎo)致的發(fā)育障礙,自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)包括一系列神經(jīng)發(fā)育疾病,主要表現(xiàn)出三種特征：社會(huì)交往和語(yǔ)言交流障礙,重復(fù)刻板的行為和狹隘興趣。Shank3基因的突變被認(rèn)為是ASD中神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)行為不良的重要原因。在本研究中,我們將探討使用新的基因編輯技術(shù)(gene editing technology) ——CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9),結(jié)合優(yōu)化了的食蟹猴輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies, ARTs),初步研究制備攜帶與人類遺傳突變有關(guān)的自閉癥基因修飾食蟹猴。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了食蟹猴重復(fù)超排研究。使用重組人促卵泡激素(recombinant human follicular stimulation hormone, rhFSH)對(duì)食蟹猴全年進(jìn)行重復(fù)超排。對(duì)128只成年食蟹猴每天早晚兩次肌肉注射1.375μg rhFSH,連續(xù)8天,第9天肌肉注射83.3μg hCG (human chorionic gonadotropin, hCG)。首次超排研究發(fā)現(xiàn),在一年的春(1-3月)夏(4-6月)秋(7-9月)冬(10-12月)四個(gè)季節(jié)中,卵巢應(yīng)答和卵巢收集均無(wú)顯著性差異。經(jīng)過(guò)首次超排后,第一次月經(jīng)周期變短,第二次月經(jīng)周期則變長(zhǎng),第三(28.5±2.8天)、四次月經(jīng)周期(27.8±3.4天)則恢復(fù)到與超排前月經(jīng)周期(28.6±3天)一致。因此間隔2、3、4個(gè)月經(jīng)周期對(duì)食蟹猴進(jìn)行再次超排,卵巢應(yīng)答和卵巢收集均與第一次超排結(jié)果相似,均無(wú)顯著性差異。首次超排結(jié)果可以預(yù)計(jì)后面兩次重復(fù)超排,經(jīng)過(guò)前四次重復(fù)超排,較好應(yīng)答的食蟹猴卵巢收集均無(wú)顯著性差異,每次超排取卵數(shù)分別為39.8±24.3,33.8±11.9,35.4±26.9,37.4±20.4。但是第五次重復(fù)超排效果則比前四次顯著降低�？傊�,食蟹猴全年任何時(shí)期都可以啟動(dòng)超排,間隔兩個(gè)月經(jīng)周期可以再次進(jìn)行超排,每只食蟹猴可以至少重復(fù)四次超排。本研究使用CRISPR/Cas9基因修飾載體對(duì)食蟹猴胚胎基因組的shank3基因進(jìn)行靶向敲除。通過(guò)對(duì)食蟹猴1細(xì)胞胚胎共注射Cas9 mRNA和sgRNA,經(jīng)體外培養(yǎng)后,得到3枚桑椹胚或囊胚,通過(guò)T7EN1酶切實(shí)驗(yàn)以及sanger測(cè)序均檢測(cè)到位點(diǎn)特異性修飾,說(shuō)明CRISPR/Cas9工程核酸酶可以有效地對(duì)食蟹猴胚胎進(jìn)行基因修飾,為后期研制shank3基因敲除食蟹猴提供重要佐證。
【關(guān)鍵詞】：自閉癥 shank3 食蟹猴 超數(shù)排卵 CRISPR/Cas9
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.8;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 主要縮略詞12-13
• 第一章 引言13-33
• 1.1 自閉癥譜系障礙概述13-16
• 1.1.1 Shank3基因13-14
• 1.1.2 SHANK3蛋白14-15
• 1.1.3 Shank3基因敲除小鼠模型研究概述15-16
• 1.2 CRISPR技術(shù)的概述16-20
• 1.2.1 CRISPR的基本結(jié)構(gòu)和工作原理17-18
• 1.2.2 CRISPR體系在基因修飾中的作用18-20
• 1.3 獼猴輔助生殖技術(shù)的概述20-26
• 1.3.1 精液采集20-21
• 1.3.2 超數(shù)排卵21-24
• 1.3.3 胚胎的獲取24
• 1.3.4 胚胎培養(yǎng)24-25
• 1.3.5 胚胎移植25-26
• 1.4 遺傳修飾靈長(zhǎng)類動(dòng)物26-30
• 1.5 本論文的研究目的和技術(shù)方案30-33
• 第二章 食蟹猴超數(shù)排卵的研究33-45
• 2.1 材料和方法33-36
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器33
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑及配方33-34
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件34
• 2.1.4 月經(jīng)周期觀察34
• 2.1.5 超數(shù)排卵34
• 2.1.6 腹腔鏡取卵34-35
• 2.1.7 卵母細(xì)胞收集35-36
• 2.1.8 統(tǒng)計(jì)分析36
• 2.2 結(jié)論36-42
• 2.2.1 季節(jié)對(duì)食蟹猴超數(shù)排卵的影響36-37
• 2.2.2 間隔不同月經(jīng)周期對(duì)重復(fù)超排的影響37-39
• 2.2.3 多次重復(fù)超排對(duì)卵巢應(yīng)答的影響39-42
• 2.3 討論42-45
• 第三章 食蟹猴胚胎shank3基因靶向敲除的研究45-60
• 3.1 材料和方法45-55
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器45
• 3.1.2 主要試劑及配方45-47
• 3.1.3 直腸電刺激采精47-48
• 3.1.4 基因修飾載體體系優(yōu)化與篩選48-49
• 3.1.5 胚胎操作49-51
• 3.1.5.1 胚胎獲取——ICSI49
• 3.1.5.2 載體注射49-50
• 3.1.5.3 胚胎培養(yǎng)50-51
• 3.1.5.4 收集胚胎51
• 3.1.6 分子實(shí)驗(yàn)操作51-55
• 3.2 結(jié)論55-58
• 3.2.1 CRISPR有效地誘導(dǎo)食蟹猴胚胎shank3基因打靶55-57
• 3.2.2 Shank3基因敲除胚胎sanger測(cè)序57-58
• 3.3 討論58-60
• 致謝60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄68

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1 馬云瀚;食蟹猴超數(shù)排卵及shank3基因敲除胚胎初步研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：286789