本文關鍵詞：食蟹猴超數(shù)排卵及shank3基因敲除胚胎初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自閉癥也稱為孤獨癥,是由于神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)而導致的發(fā)育障礙,自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)包括一系列神經(jīng)發(fā)育疾病,主要表現(xiàn)出三種特征：社會交往和語言交流障礙,重復刻板的行為和狹隘興趣。Shank3基因的突變被認為是ASD中神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)行為不良的重要原因。在本研究中,我們將探討使用新的基因編輯技術(gene editing technology) ——CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9),結合優(yōu)化了的食蟹猴輔助生殖技術(assisted reproductive technologies, ARTs),初步研究制備攜帶與人類遺傳突變有關的自閉癥基因修飾食蟹猴。本實驗進行了食蟹猴重復超排研究。使用重組人促卵泡激素(recombinant human follicular stimulation hormone, rhFSH)對食蟹猴全年進行重復超排。對128只成年食蟹猴每天早晚兩次肌肉注射1.375μg rhFSH,連續(xù)8天,第9天肌肉注射83.3μg hCG (human chorionic gonadotropin, hCG)。首次超排研究發(fā)現(xiàn),在一年的春(1-3月)夏(4-6月)秋(7-9月)冬(10-12月)四個季節(jié)中,卵巢應答和卵巢收集均無顯著性差異。經(jīng)過首次超排后,第一次月經(jīng)周期變短,第二次月經(jīng)周期則變長,第三(28.5±2.8天)、四次月經(jīng)周期(27.8±3.4天)則恢復到與超排前月經(jīng)周期(28.6±3天)一致。因此間隔2、3、4個月經(jīng)周期對食蟹猴進行再次超排,卵巢應答和卵巢收集均與第一次超排結果相似,均無顯著性差異。首次超排結果可以預計后面兩次重復超排,經(jīng)過前四次重復超排,較好應答的食蟹猴卵巢收集均無顯著性差異,每次超排取卵數(shù)分別為39.8±24.3,33.8±11.9,35.4±26.9,37.4±20.4。但是第五次重復超排效果則比前四次顯著降低�？傊�,食蟹猴全年任何時期都可以啟動超排,間隔兩個月經(jīng)周期可以再次進行超排,每只食蟹猴可以至少重復四次超排。本研究使用CRISPR/Cas9基因修飾載體對食蟹猴胚胎基因組的shank3基因進行靶向敲除。通過對食蟹猴1細胞胚胎共注射Cas9 mRNA和sgRNA,經(jīng)體外培養(yǎng)后,得到3枚桑椹胚或囊胚,通過T7EN1酶切實驗以及sanger測序均檢測到位點特異性修飾,說明CRISPR/Cas9工程核酸酶可以有效地對食蟹猴胚胎進行基因修飾,為后期研制shank3基因敲除食蟹猴提供重要佐證。
【關鍵詞】：自閉癥 shank3 食蟹猴 超數(shù)排卵 CRISPR/Cas9
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 主要縮略詞12-13
• 第一章 引言13-33
• 1.1 自閉癥譜系障礙概述13-16
• 1.1.1 Shank3基因13-14
• 1.1.2 SHANK3蛋白14-15
• 1.1.3 Shank3基因敲除小鼠模型研究概述15-16
• 1.2 CRISPR技術的概述16-20
• 1.2.1 CRISPR的基本結構和工作原理17-18
• 1.2.2 CRISPR體系在基因修飾中的作用18-20
• 1.3 獼猴輔助生殖技術的概述20-26
• 1.3.1 精液采集20-21
• 1.3.2 超數(shù)排卵21-24
• 1.3.3 胚胎的獲取24
• 1.3.4 胚胎培養(yǎng)24-25
• 1.3.5 胚胎移植25-26
• 1.4 遺傳修飾靈長類動物26-30
• 1.5 本論文的研究目的和技術方案30-33
• 第二章 食蟹猴超數(shù)排卵的研究33-45
• 2.1 材料和方法33-36
• 2.1.1 實驗主要儀器33
• 2.1.2 實驗主要試劑及配方33-34
• 2.1.3 實驗動物及飼養(yǎng)條件34
• 2.1.4 月經(jīng)周期觀察34
• 2.1.5 超數(shù)排卵34
• 2.1.6 腹腔鏡取卵34-35
• 2.1.7 卵母細胞收集35-36
• 2.1.8 統(tǒng)計分析36
• 2.2 結論36-42
• 2.2.1 季節(jié)對食蟹猴超數(shù)排卵的影響36-37
• 2.2.2 間隔不同月經(jīng)周期對重復超排的影響37-39
• 2.2.3 多次重復超排對卵巢應答的影響39-42
• 2.3 討論42-45
• 第三章 食蟹猴胚胎shank3基因靶向敲除的研究45-60
• 3.1 材料和方法45-55
• 3.1.1 實驗主要儀器45
• 3.1.2 主要試劑及配方45-47
• 3.1.3 直腸電刺激采精47-48
• 3.1.4 基因修飾載體體系優(yōu)化與篩選48-49
• 3.1.5 胚胎操作49-51
• 3.1.5.1 胚胎獲取——ICSI49
• 3.1.5.2 載體注射49-50
• 3.1.5.3 胚胎培養(yǎng)50-51
• 3.1.5.4 收集胚胎51
• 3.1.6 分子實驗操作51-55
• 3.2 結論55-58
• 3.2.1 CRISPR有效地誘導食蟹猴胚胎shank3基因打靶55-57
• 3.2.2 Shank3基因敲除胚胎sanger測序57-58
• 3.3 討論58-60
• 致謝60-61
• 參考文獻61-68
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄68

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1 費舟;張磊;劉偉;;缺血再灌注腦Shank蛋白亞型的變化及意義[A];第二屆西部神經(jīng)外科學術會議論文集[C];2010年

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本文編號：286789