目的:卵巢癌是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的主要原因。已有許多藥物用于治療卵巢癌并可以改善患者的預(yù)后。以鉑類為基礎(chǔ)的化療已成為局部晚期或轉(zhuǎn)移癌患者的一線治療方案,但臨床化療耐藥性是晚期卵巢癌患者治療的主要障礙,因此,如何逆轉(zhuǎn)卵巢癌的化療耐藥性成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的、不編碼蛋白的RNA,已被證實(shí)為人類各種癌癥發(fā)生與發(fā)展的調(diào)節(jié)因子。目前,許多測(cè)序技術(shù)已經(jīng)表明LncRNAs在耐藥和敏感的癌癥細(xì)胞中存在差異表達(dá),并通過細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、DNA損傷修復(fù)作用、DNA甲基化等途徑影響癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。因此,研究LncRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及放療、化療敏感性中的作用和潛在的分子機(jī)制具有重大的臨床意義。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs可作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA,通過miRNA反應(yīng)元件與microRNAs及其下游靶基因直接結(jié)合,互相調(diào)控彼此的表達(dá)水平和生物學(xué)功能。Linc00312,位于染色體3p25.3上,在多種疾病中的表達(dá)顯著失調(diào),并作為腫瘤抑制基因起著關(guān)鍵作用。此外,Linc00312通過與特定miRNA相互作用在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、分化和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。但Linc00312與卵巢癌化療耐藥性的關(guān)系及分子機(jī)制尚不清楚。本研究以Linc00312為研究對(duì)象,采用qRT-PCR與原位雜交技術(shù)深入了解其與卵巢癌化療耐藥性的相關(guān)關(guān)系;構(gòu)建siRNA以及過表達(dá)質(zhì)粒,通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot等實(shí)驗(yàn)方法探索Linc00312逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑化療耐藥性的作用機(jī)制;通過軟件預(yù)測(cè)尋找其直接結(jié)合的microRNA及其靶基因,同時(shí)明確miR-196a-5p與ZMYND11在逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑化療耐藥性中的作用以及三者之間的相關(guān)性,進(jìn)而闡明Linc00312可通過抑制miR-196a-5p調(diào)控靶基因ZMYND11的表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑的化療耐藥性,為探索卵巢癌的治療方法提供了新的思路。研究方法:第一部分:利用qRT-PCR與原位雜交檢測(cè)Linc00312在卵巢漿液性癌組織中的表達(dá),并通過對(duì)患者預(yù)后隨訪,統(tǒng)計(jì)Linc00312與卵巢癌臨床病理生物學(xué)特征的相關(guān)性。qRT-PCR檢測(cè)卵巢癌敏感細(xì)胞系SKOV3與耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP中Linc00312的差異表達(dá)。分別轉(zhuǎn)染Linc00312 siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒至SKOV3與SKOV3/DDP內(nèi),CCK-8檢測(cè)經(jīng)順鉑處理后細(xì)胞抑制率,并計(jì)算半抑制濃度IC50;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;qRT-PCR與Western Blot檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白MDR1、MRP1以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的mRNA與蛋白水平的變化情況。第二部分:通過軟件預(yù)測(cè)分析尋找Linc00312相互作用的microRNA。利用qRT-PCR檢測(cè)miR-196a-5p在卵巢漿液性癌化療耐藥與敏感組織和細(xì)胞中的差異表達(dá),并利用Pearson相關(guān)性分析判斷Linc00312與miR-196a-5p的相關(guān)關(guān)系。轉(zhuǎn)染 miR-196a-5p mimics 與 inhibitor,利用 CCK-8、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Western Blot檢測(cè)miR-196a-5p與卵巢癌對(duì)順鉑化療耐藥的相關(guān)性。利用qRT-PCR檢測(cè)Linc00312與miR-196a-5p之間的調(diào)控關(guān)系;進(jìn)一步構(gòu)建PMIR-Linc00312,通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)Linc00312與miR-196a-5p的直接調(diào)控關(guān)系。第三部分:利用免疫組化與Western Blot檢測(cè)ZMYND11在卵巢漿液性癌化療耐藥與敏感組織中的表達(dá)情況,并統(tǒng)計(jì)分析其與卵巢癌臨床病理生物學(xué)特征的相關(guān)關(guān)系。利用qRT-PCR與Western Blot檢測(cè)SKOV3與SKOV3/DDP細(xì)胞中ZMYND11的差異表達(dá)。轉(zhuǎn)染ZMYND11 siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒,CCK-8、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、Western Blot檢測(cè)不同表達(dá)水平的ZMYND11對(duì)卵巢癌化療耐藥的影響。轉(zhuǎn)染Linc00312 siRNA、過表達(dá)質(zhì)粒以及miR-196a-5p mimics、inhibitor,利用Western Blot檢測(cè)ZMYND11的蛋白水平變化,驗(yàn)證二者對(duì)ZMYND11 的調(diào)控作用。通過 TargetScan 預(yù)測(cè) miR-196a-5p 與 ZMYND11 3'UTR 的結(jié)合位點(diǎn),利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證Linc00312可通過miR-196a-5p調(diào)控ZYMND11。結(jié)果:第一部分:Linc00312在卵巢漿液性癌化療耐藥組織中的表達(dá)顯著低于化療敏感組織,且主要在細(xì)胞漿中表達(dá);其低表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期有關(guān),但與患者年齡、腫瘤分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)性。Linc00312在卵巢癌化療耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP中的表達(dá)顯著低于敏感細(xì)胞系SKOV3。抑制Linc00312的表達(dá),順鉑處理后,SKOV3細(xì)胞抑制率降低、凋亡率減少,IC50由4.297±0.148ltg/ml增高至6.308±0.299μg/ml。耐藥相關(guān)蛋白MDR1與MRP1、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2mRNA與蛋白表達(dá)水平增高,而Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平顯著降低。Linc00312過表達(dá)后,SKOV3/DDP則出現(xiàn)相反趨勢(shì)。第二部分:miR-196a-5p在卵巢漿液性癌化療耐藥組織中的表達(dá)顯著高于化療敏感組織。與SK0V3相比,miR-196a-5p在SKOV3/DDP中表達(dá)增高。在SKOV3細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,miR-196a-5pmimics組的細(xì)胞抑制率、凋亡率明顯下降,順鉑對(duì)細(xì)胞的IC50升高;在SKOV3/DDP細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,miR-196a-5p inhibitor組中的細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著增高,IC50降低。Linc00312與miR-196a-5p之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn),可負(fù)向調(diào)控彼此的表達(dá)水平,并共同抑制MDR1、MRPI蛋白表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性。第三部分:與卵巢癌化療敏感組織和細(xì)胞相比,ZMYND11在耐藥組織和細(xì)胞中呈低表達(dá),且其低表達(dá)與卵巢癌患者年齡、FIGO分期、腫瘤分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無相關(guān)性。ZMYND11的低表達(dá)可使SKOV3細(xì)胞抑制率、凋亡率下降,IC50升高,MDRI、MRP1的表達(dá)增高;而在SKOV3/DDP細(xì)胞中高表達(dá)后,上述趨勢(shì)剛好相反。敲低Linc00312的表達(dá),ZMYND11的蛋白表達(dá)水平顯著降低;而過表達(dá)Linc00312后,ZMYND11的蛋白表達(dá)水平亦隨之升高。MiR-196a-5p與ZMYND11亦存在靶向結(jié)合位點(diǎn);Linc00312與miR-196a-5p可共同調(diào)控ZMYND11的mRNA與蛋白表達(dá)水平,從而影響卵巢癌對(duì)順鉑的化療敏感性。結(jié)論:第一部分:與卵巢癌化療敏感組織與細(xì)胞相比,Linc00312在化療耐藥組織和細(xì)胞中呈低表達(dá),且其低表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期有關(guān);Linc00312可通過Bcl-2/Caspase-3細(xì)胞凋亡途徑逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑的化療耐藥性;第二部分:miR-196a-5p在卵巢癌化療耐藥組織和細(xì)胞中呈高表達(dá);Linc00312可通過抑制miR-196a-5p的表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑的化療耐藥性;第三部分:ZMYND11在卵巢癌化療耐藥組織和細(xì)胞中呈低表達(dá),其低表達(dá)與卵巢癌患者年齡、FIGO分期、腫瘤分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無相關(guān)性;Linc00312通過miR-196a-5p調(diào)控靶基因ZMYND11的表達(dá)逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)順鉑的化療耐藥性。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 Linc00312 在卵巢癌化療耐藥與敏感組織中的表達(dá)首先，我們采用 qRT-PCR 方法檢測(cè)卵巢漿液性癌化療耐藥與敏感組織各 60 例中 Linc00312 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)，與化療敏感組織相比，化療耐藥組織中 Linc00312 的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）（圖 3.1.1A，△ct 值越高，表達(dá)量越低）。進(jìn)一步制作ROC 曲線分析通過 Linc00312 來評(píng)估卵巢癌患者化療耐藥與否的準(zhǔn)確性，提示 AUC為 0.907， 95％CI：0.854-0.960（P<0.01）（圖 3.1.1B）。當(dāng) cut-off 值為 7.522 時(shí)，其靈敏度為 91.7％，特異性為 80％。

圖 3.1.2 ISH 檢測(cè)在卵巢漿液性癌石蠟組織切片中 Linc00312 的表達(dá)。A，C：化療敏感組織，A×200，C×400; B，D：化療耐藥組織，B×200，D×400表 3.1 ISH 檢測(cè)在卵巢漿液性癌石蠟組織切片中 Linc00312 的表達(dá)N Linc00312 表達(dá) 高表達(dá)數(shù) 高表達(dá)率 P分組 - + ++ +++ N (%)敏感 40 0 16 19 5 24 60.0耐藥 40 0 29 11 0 11 27.5 0.0389注：* 敏感 vs. 耐藥, * P = 0.03893.2 Linc00312 與卵巢漿液性癌臨床病理生物學(xué)特征的相關(guān)性通過對(duì)卵巢漿液性癌石蠟組織切片患者的隨訪，我們發(fā)現(xiàn) Linc00312 的表達(dá)降低與卵巢癌的 FIGO 分期有關(guān)（P=0.042），但與患者年齡、腫瘤分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

I 19 16 3 IV 61 29 32化 13 8 5 化 67 37 30移 44 17 27 36 28 82 在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)情況Real-time PCR 檢測(cè)人卵巢癌細(xì)胞 SKOV3 與 達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 SKOV3 相比，SKOV3/DDPP <0.01，圖 3.3）。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張傳琪;Linc00312通過miR-196a-5p調(diào)節(jié)ZMYND11逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥性的作用與機(jī)制研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2019年

2 楊吉鵬;ZMYND11在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中作用及機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2858354