細(xì)胞的生長(zhǎng)需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng),谷氨酰胺對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝有著至關(guān)重要的作用。小鼠成纖維(L)細(xì)胞和人宮頸腺癌(HeLa)細(xì)胞利用谷氨酰胺的研究可以追溯到20世紀(jì)50年代,有研究表明兩株細(xì)胞在谷氨酰胺和谷氨酸的利用上存在著差異。本文考察了谷氨酰胺和谷氨酸對(duì)L細(xì)胞和He La細(xì)胞的作用差異,并建立了細(xì)胞代謝組學(xué)分析方法。利用這一方法分析L細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在谷氨酰胺或谷氨酸培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物特征及變化規(guī)律,進(jìn)一步闡明兩株細(xì)胞利用谷氨酰胺或谷氨酸差異的原因。本文首先考察L細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中,對(duì)谷氨酰胺或谷氨酸的利用上所存在的差異。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),L細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在正常生長(zhǎng)過(guò)程中,只有當(dāng)培養(yǎng)基中的谷氨酰胺濃度達(dá)到2 mmol/L以上時(shí),才能維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)增殖。使用谷氨酸單鈉替代培養(yǎng)基中的谷氨酰胺培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),20 mmol/L谷氨酸單鈉可以維持HeLa細(xì)胞生長(zhǎng),卻不足以維持L細(xì)胞生長(zhǎng)。隨后,對(duì)兩種細(xì)胞的胞內(nèi)氨基酸水平進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞內(nèi)的11種氨基酸含量存在顯著性差異。最后,考察了使用谷氨酸單鈉替代谷氨酰胺培養(yǎng)兩株細(xì)胞時(shí),谷氨酰胺和谷氨酸代謝相關(guān)酶活性變化。結(jié)果表明HeLa細(xì)胞的谷氨酰胺代謝相關(guān)酶活性上升,而L細(xì)胞的對(duì)應(yīng)酶活沒(méi)有明顯變化。其次,本文建立細(xì)胞的代謝組學(xué)分析方法,選取5種代表化合物考察方法的線性范圍(0.02~200 mg/L)、相關(guān)系數(shù)(0.9949~0.9997)、檢出限(0.001~0.002mg/L),方法回收率(88.7%~102.6%),結(jié)果表明該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,用于細(xì)胞代謝組學(xué)分析時(shí)能夠得到可靠的信息。最后,應(yīng)用建立的細(xì)胞代謝組學(xué)分析方法,詳細(xì)研究L細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別在谷氨酰胺或谷氨酸培養(yǎng)條件下,0 h、12 h、24 h、48 h、72 h這5個(gè)時(shí)間點(diǎn),代謝產(chǎn)物的特征及變化規(guī)律。分析結(jié)果顯示:L細(xì)胞和He La細(xì)胞在谷氨酰胺缺乏、添加谷氨酰胺、添加谷氨酸單鈉的三種培養(yǎng)條件下,其胞內(nèi)代謝產(chǎn)物輪廓圖存在明顯差異。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,篩選出L細(xì)胞和HeLa細(xì)胞分別在上述三種培養(yǎng)條件下的差異性代謝產(chǎn)物,主要包括糖類、堿基類、有機(jī)酸類等。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

圖 1-1 代謝組學(xué)分析流程Fig. 1-1 Procedures of metabolomics analysis2.1.1 細(xì)胞樣品的制備細(xì)胞樣品的制備是代謝組學(xué)研究的初始步驟和關(guān)鍵步驟，制備的主要步驟包括細(xì)滅和代謝物提取[53]。理想的淬滅處理應(yīng)該在胞內(nèi)代謝物不泄漏的前提下使得胞內(nèi)酶失活，代謝變化停止[54]。對(duì)于細(xì)胞樣品處理的要求主要是簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，采用有機(jī)溶劑低溫處理[55]。Lauri 等[56]在對(duì)人結(jié)腸癌 HCT116 細(xì)胞的代謝物分析時(shí)液氮淬滅，其優(yōu)點(diǎn)是速度快且不發(fā)生胞內(nèi)物泄漏。淬滅前須用磷酸緩沖（PBS）溶細(xì)胞進(jìn)行多次清洗以去除培養(yǎng)液等基質(zhì)的殘留。Zhang 等[57]在針對(duì)人的心肌 AC16的研究中發(fā)現(xiàn)，用預(yù)冷的 PBS 溶液淬滅方式不傷害細(xì)胞，有效遏制了胞內(nèi)物的泄代謝物具有不同的物理和化學(xué)性質(zhì)，理想的提取方法應(yīng)盡可能多的把胞內(nèi)所有代提取出來(lái)，定量效果好且有良好的重復(fù)性。液-液萃取法是最為廣泛使用的方法，萃取劑有甲醇、乙腈、氯仿等。García-Ca averas 等[58]以人肝癌 HepG2 細(xì)胞為研究，探究貼壁生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝組學(xué)分析中可優(yōu)化的步驟，比較代謝物提取劑

圖 3-1（b）不同濃度谷氨酰胺培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞 24 h、48 h、72 h 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響ig. 3-1（b）Effects of different concentrations of Glutamine for 24h, 48h, 72h on HeLa celluproliferation如圖 3-1 (a) 結(jié)果所示，隨著谷氨酰胺濃度的改變，L 細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目都。隨著谷氨酰胺濃度的降低，原本梭狀的 L 細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞發(fā)生數(shù)目減少，細(xì)胞變圓從皿底脫落并懸浮于培養(yǎng)基中。當(dāng)谷氨酰胺濃度為 0 m幾乎無(wú)貼壁細(xì)胞，表明細(xì)胞已經(jīng)漂浮死亡。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，能夠發(fā)現(xiàn)度為 0.5 mmol/L、1 mmol/L 的各組，細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)少于 2 mmol/L 和 4 mmol/L 量為 0.5 mmol/L、1 mmol/L 組在 24 h、48 h 細(xì)胞數(shù)目維持在增加的狀態(tài)，但再增加，說(shuō)明 L 細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)谷氨酰胺可能存在著劑量依賴關(guān)系。正常生長(zhǎng)的 HeLa 細(xì)胞呈相對(duì)規(guī)則的多角形，細(xì)胞大小均勻，生長(zhǎng)迅速，貼無(wú)脫落。如圖 3-1 (b) 結(jié)果所示，HeLa 細(xì)胞也隨著谷氨酰胺濃度的變化，其都發(fā)生了改變。隨著谷氨酰胺濃度的降低，HeLa 細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)。與 L 細(xì)胞的結(jié)果相似，當(dāng)谷氨酰胺濃度為 0 mmol/L 時(shí)，HeLa 細(xì)胞變圓從懸浮于培養(yǎng)基中，幾乎無(wú)貼壁細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，谷氨酰胺濃度低的

3.1.1.2 谷氨酰胺對(duì) L 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞增殖的影響MTT 實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用方法。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），因其不溶于水而沉積在細(xì)胞中。使用二甲亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀測(cè)定 570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，在一定范圍內(nèi)，藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶形成的量與細(xì)胞增殖水平成正比，并可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。為進(jìn)一步驗(yàn)證谷氨酰胺在 L 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖過(guò)程中的作用，采用含不同濃度谷氨酰胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，以正常 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組，分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h 后，用 MTT 實(shí)驗(yàn)測(cè)定吸光度值。結(jié)果如下圖 3-2 所示，隨著谷氨酰胺濃度的升高，L 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞的增殖水平也隨之發(fā)生改變：谷氨酰胺濃度在 0 -2 mmol/L 范圍內(nèi)時(shí)，L 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞的增殖水平均隨著谷氨酰胺濃度的增加而上升，這與顯微鏡下細(xì)胞拍照結(jié)果相同；當(dāng)谷氨酰胺濃度達(dá)到 2 mmol/L 以上時(shí)，L 細(xì)胞和 HeLa細(xì)胞的細(xì)胞增殖水平均達(dá)到與正常對(duì)照組相同。橫向比較 24 h、48 h、72 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，L 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞在谷氨酰胺濃度為 0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 三個(gè)組別的細(xì)胞增殖水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。
【參考文獻(xiàn)】

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