細胞的生長需要大量的營養(yǎng)物質供應,谷氨酰胺對于細胞的生長和代謝有著至關重要的作用。小鼠成纖維(L)細胞和人宮頸腺癌(HeLa)細胞利用谷氨酰胺的研究可以追溯到20世紀50年代,有研究表明兩株細胞在谷氨酰胺和谷氨酸的利用上存在著差異。本文考察了谷氨酰胺和谷氨酸對L細胞和He La細胞的作用差異,并建立了細胞代謝組學分析方法。利用這一方法分析L細胞和HeLa細胞在谷氨酰胺或谷氨酸培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物特征及變化規(guī)律,進一步闡明兩株細胞利用谷氨酰胺或谷氨酸差異的原因。本文首先考察L細胞和HeLa細胞在生長過程中,對谷氨酰胺或谷氨酸的利用上所存在的差異。研究結果發(fā)現(xiàn),L細胞和HeLa細胞在正常生長過程中,只有當培養(yǎng)基中的谷氨酰胺濃度達到2 mmol/L以上時,才能維持細胞的正常生長增殖。使用谷氨酸單鈉替代培養(yǎng)基中的谷氨酰胺培養(yǎng)細胞時,20 mmol/L谷氨酸單鈉可以維持HeLa細胞生長,卻不足以維持L細胞生長。隨后,對兩種細胞的胞內(nèi)氨基酸水平進行了測定,發(fā)現(xiàn)兩株細胞內(nèi)的11種氨基酸含量存在顯著性差異。最后,考察了使用谷氨酸單鈉替代谷氨酰胺培養(yǎng)兩株細胞時,谷氨酰胺和谷氨酸代謝相關酶活性變化。結果表明HeLa細胞的谷氨酰胺代謝相關酶活性上升,而L細胞的對應酶活沒有明顯變化。其次,本文建立細胞的代謝組學分析方法,選取5種代表化合物考察方法的線性范圍(0.02~200 mg/L)、相關系數(shù)(0.9949~0.9997)、檢出限(0.001~0.002mg/L),方法回收率(88.7%~102.6%),結果表明該方法具有較高的靈敏度和準確度,用于細胞代謝組學分析時能夠得到可靠的信息。最后,應用建立的細胞代謝組學分析方法,詳細研究L細胞和HeLa細胞分別在谷氨酰胺或谷氨酸培養(yǎng)條件下,0 h、12 h、24 h、48 h、72 h這5個時間點,代謝產(chǎn)物的特征及變化規(guī)律。分析結果顯示:L細胞和He La細胞在谷氨酰胺缺乏、添加谷氨酰胺、添加谷氨酸單鈉的三種培養(yǎng)條件下,其胞內(nèi)代謝產(chǎn)物輪廓圖存在明顯差異。通過多元統(tǒng)計學方法,篩選出L細胞和HeLa細胞分別在上述三種培養(yǎng)條件下的差異性代謝產(chǎn)物,主要包括糖類、堿基類、有機酸類等。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

圖 1-1 代謝組學分析流程Fig. 1-1 Procedures of metabolomics analysis2.1.1 細胞樣品的制備細胞樣品的制備是代謝組學研究的初始步驟和關鍵步驟，制備的主要步驟包括細滅和代謝物提取[53]。理想的淬滅處理應該在胞內(nèi)代謝物不泄漏的前提下使得胞內(nèi)酶失活，代謝變化停止[54]。對于細胞樣品處理的要求主要是簡便、快速、重復性好，采用有機溶劑低溫處理[55]。Lauri 等[56]在對人結腸癌 HCT116 細胞的代謝物分析時液氮淬滅，其優(yōu)點是速度快且不發(fā)生胞內(nèi)物泄漏。淬滅前須用磷酸緩沖（PBS）溶細胞進行多次清洗以去除培養(yǎng)液等基質的殘留。Zhang 等[57]在針對人的心肌 AC16的研究中發(fā)現(xiàn)，用預冷的 PBS 溶液淬滅方式不傷害細胞，有效遏制了胞內(nèi)物的泄代謝物具有不同的物理和化學性質，理想的提取方法應盡可能多的把胞內(nèi)所有代提取出來，定量效果好且有良好的重復性。液-液萃取法是最為廣泛使用的方法，萃取劑有甲醇、乙腈、氯仿等。García-Ca averas 等[58]以人肝癌 HepG2 細胞為研究，探究貼壁生長的哺乳動物細胞代謝組學分析中可優(yōu)化的步驟，比較代謝物提取劑

圖 3-1（b）不同濃度谷氨酰胺培養(yǎng) HeLa 細胞 24 h、48 h、72 h 對細胞形態(tài)的影響ig. 3-1（b）Effects of different concentrations of Glutamine for 24h, 48h, 72h on HeLa celluproliferation如圖 3-1 (a) 結果所示，隨著谷氨酰胺濃度的改變，L 細胞的形態(tài)和數(shù)目都。隨著谷氨酰胺濃度的降低，原本梭狀的 L 細胞形態(tài)變得不規(guī)則，細胞發(fā)生數(shù)目減少，細胞變圓從皿底脫落并懸浮于培養(yǎng)基中。當谷氨酰胺濃度為 0 m幾乎無貼壁細胞，表明細胞已經(jīng)漂浮死亡。隨著培養(yǎng)時間的延長，能夠發(fā)現(xiàn)度為 0.5 mmol/L、1 mmol/L 的各組，細胞數(shù)目遠少于 2 mmol/L 和 4 mmol/L 量為 0.5 mmol/L、1 mmol/L 組在 24 h、48 h 細胞數(shù)目維持在增加的狀態(tài)，但再增加，說明 L 細胞的生長對谷氨酰胺可能存在著劑量依賴關系。正常生長的 HeLa 細胞呈相對規(guī)則的多角形，細胞大小均勻，生長迅速，貼無脫落。如圖 3-1 (b) 結果所示，HeLa 細胞也隨著谷氨酰胺濃度的變化，其都發(fā)生了改變。隨著谷氨酰胺濃度的降低，HeLa 細胞形態(tài)變得不規(guī)則，細。與 L 細胞的結果相似，當谷氨酰胺濃度為 0 mmol/L 時，HeLa 細胞變圓從懸浮于培養(yǎng)基中，幾乎無貼壁細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，谷氨酰胺濃度低的

3.1.1.2 谷氨酰胺對 L 細胞和 HeLa 細胞增殖的影響MTT 實驗是一種檢測細胞增殖的常用方法。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為藍紫色結晶甲瓚（Formazan），因其不溶于水而沉積在細胞中。使用二甲亞砜（DMSO）溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀測定 570 nm 波長處的吸光度值，在一定范圍內(nèi)，藍紫色甲瓚結晶形成的量與細胞增殖水平成正比，并可間接反映活細胞數(shù)量。為進一步驗證谷氨酰胺在 L 細胞和 HeLa 細胞正常生長增殖過程中的作用，采用含不同濃度谷氨酰胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，以正常 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞為對照組，分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h 后，用 MTT 實驗測定吸光度值。結果如下圖 3-2 所示，隨著谷氨酰胺濃度的升高，L 細胞和 HeLa 細胞的增殖水平也隨之發(fā)生改變：谷氨酰胺濃度在 0 -2 mmol/L 范圍內(nèi)時，L 細胞和 HeLa 細胞的增殖水平均隨著谷氨酰胺濃度的增加而上升，這與顯微鏡下細胞拍照結果相同；當谷氨酰胺濃度達到 2 mmol/L 以上時，L 細胞和 HeLa細胞的細胞增殖水平均達到與正常對照組相同。橫向比較 24 h、48 h、72 h 三個時間點的細胞增殖水平時發(fā)現(xiàn)，L 細胞和 HeLa 細胞在谷氨酰胺濃度為 0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 三個組別的細胞增殖水平隨著培養(yǎng)時間的延長而降低。
【參考文獻】

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本文編號：2856611