前言子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有疾病,是引起孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病和死亡的主要原因之一,其主要臨床表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)以高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯娜矶嘞到y(tǒng)綜合征,發(fā)病率占孕婦的5%-8%。已有大量的假說(shuō)和理論闡述子癇前期的病因?qū)W,如異常的免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、異常的胎盤植入、胎盤功能以及遺傳因素等。國(guó)外學(xué)者提出了子癇前期發(fā)病機(jī)制的“兩階段學(xué)說(shuō)”。其中核心內(nèi)容包括:第一階段,在孕早期,由于免疫、遺傳、內(nèi)皮細(xì)胞紊亂等因素可造成子宮螺旋小動(dòng)脈生理性“血管重鑄”障礙,滋養(yǎng)細(xì)胞因缺血導(dǎo)致侵襲力減弱,造成“胎盤淺著床”,子宮動(dòng)脈血流阻力增加,致使胎盤功能下降;第二階段,孕中晚期,由于缺血缺氧的胎盤局部氧化應(yīng)激反應(yīng),誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而釋放大量炎癥因子,形成炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)和過(guò)度炎癥的發(fā)生,而導(dǎo)致子癇前期及子癇的各種臨床癥狀。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其病因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究,但目前尚無(wú)確切的理論學(xué)說(shuō)能滿意并全面的解釋。因此,對(duì)子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究仍是產(chǎn)科醫(yī)生的一大挑戰(zhàn)。趨化因子是一類包含4個(gè)保守半胱氨酸殘基,具有化學(xué)趨化功能的多肽。根據(jù)其第1、第2個(gè)半胱氨酸之間所含其他氨基酸的個(gè)數(shù),可分為CXC、CC、C及C3XC四個(gè)家族。趨化因子通過(guò)與不同細(xì)胞類型的受體結(jié)合而發(fā)揮不同的功能,在n端區(qū)(CXC、CC、CX3C和C)中,趨化因子的作用可分為4個(gè)主要基團(tuán)。趨化因子的主要作用是吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部,參與免疫調(diào)節(jié)和病理反應(yīng)。趨化因子在機(jī)體中發(fā)揮重要的生理和病理效應(yīng),炎癥、腫瘤、自身免疫病等疾病的發(fā)生發(fā)展均具有趨化因子或其受體的表達(dá)異常。已有報(bào)道子癇前期孕婦與子代高血壓、糖尿病及先天性心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān),采用超聲多普勒測(cè)量心臟軸的異常對(duì)篩查胎兒心臟具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。然而,子癇前期胎兒心臟的異常是否有某些趨化因子表達(dá)異常存在相關(guān)性目前并不清楚。趨化因子CXCL9又稱MIG,人CXCL9基因位于染色體4q21上,屬于干擾素γ誘導(dǎo)的CXC家族趨化因子,主要分布在Th1、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等,有介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫及炎性反應(yīng)的作用。正常生理狀況下CXCL9在多數(shù)非淋巴組織中檢測(cè)不到,但在發(fā)生感染、損傷或免疫炎性反應(yīng)時(shí)可由干擾素γ等誘導(dǎo)而產(chǎn)生。CXCL9的受體是CXC亞族的CXCR3,而CXCR3同時(shí)也是趨化因子CXCL10和CXCL11的受體。CXCL9的趨化作用主要通過(guò)CXCR3的介導(dǎo)作用完成。我們前期研究,應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)檢測(cè)了正常妊娠孕婦胎盤和子癇前期患者胎盤組織中的基因表達(dá)差異,結(jié)果顯示CXCL9 mRNA在子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中低表達(dá),然而CXCL9在子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中蛋白的定位表達(dá)和定量表達(dá)是否也存在差異,目前尚不清楚。本研究目的是在前期研究的基礎(chǔ)上,探討CXCL9蛋白在正常妊娠和子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中定位及定量表達(dá)是否存在著差異,并對(duì)正常妊娠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及Akt信號(hào)通路作用的影響,從而進(jìn)一步探討CXCL9在子癇前期發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制。方法第一部分:病例篩選和CXCL9蛋白在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的定位表達(dá)差異收集2015年9月-2016年8月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科分娩的子癇前期患者胎盤30例,同期妊娠健康孕婦患者30例為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書,孕婦在孕周、年齡、身高、體重等一般條件匹配,月經(jīng)規(guī)則,本次妊娠經(jīng)過(guò)正常,無(wú)任何合并癥和并發(fā)癥(子癇前期除外),既往無(wú)不良妊娠史,無(wú)原發(fā)性高血壓、糖尿病、腎病、癌癥等病史,無(wú)嗜煙、嗜酒等不良生活習(xí)慣;入組孕婦均為第一次妊娠,單胎,根據(jù)末次月經(jīng)及孕早期超聲認(rèn)真仔細(xì)核對(duì)孕周。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法,檢測(cè)CXCL9蛋白在子癇前期胎盤中的定位表達(dá);應(yīng)用Western blot及Real-time PCR法,檢測(cè)CXCL9在子癇前期胎盤中蛋白和mRNA的定量表達(dá)。第二部分:CXCL9對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖、遷移及侵襲的影響體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo,通過(guò)shRNA慢病毒感染敲除CXCL9基因后,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同干預(yù)條件下滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖情況;應(yīng)用transwell法檢測(cè)敲除CXCL9基因前后滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo遷移和侵襲能力的改變。第三部分:CXCL9影響滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo侵襲機(jī)制的研究體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo,通過(guò)shRNA慢病毒感染敲除CXCL9基因后,應(yīng)用Western blot法,檢測(cè)敲除CXCL9基因前后滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)變化;應(yīng)用特異性Akt抑制劑,檢測(cè)CXCL9對(duì)下游Akt信號(hào)通路的作用影響。結(jié)果第一部分:我們利用免疫組織化學(xué)、Western blot及Real-time PCR方法檢測(cè)CXCL9在子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及正常妊娠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的定位表達(dá)變化。結(jié)果顯示CXCL9在正常妊娠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞胞核和胞漿中均呈陽(yáng)性表達(dá);而在子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞胞核和胞漿中的表達(dá)減弱及部分滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)缺失,兩者表達(dá)存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中平均密度明顯降低。應(yīng)用Western Blot和Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCL9在子癇前期胎盤組織中的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯低于正常胎盤組織,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CXCL9蛋白的定位、定量及mRNA的表達(dá)可能與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能密切相關(guān)。第二部分:應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)法,檢測(cè)CXCL9對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖能力的影響,發(fā)現(xiàn)被shRNA慢病毒感染后的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖能力明顯降低。應(yīng)用transwell法,檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲的能力,同時(shí)發(fā)現(xiàn)被shRNA慢病毒感染后的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo遷移和侵襲的能力也明顯減弱。第三部分:與陰性對(duì)照組比較,CXCL9基因被敲除后的滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表達(dá)明顯下降,磷酸化Akt(p-Akt)明顯下調(diào),而磷酸化ERK(p-ERK)水平?jīng)]有變化。在未敲除CXCL9基因的滋養(yǎng)細(xì)胞中,應(yīng)用Akt抑制劑MK-2206處理細(xì)胞后,MMP-2和MMP-9蛋白水平顯著下調(diào)。結(jié)論1.CXCL9在子癇前期胎盤中蛋白的表達(dá)明顯低于正常妊娠胎盤中蛋白的表達(dá),說(shuō)明CXCL9的低表達(dá)可能是子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞病變的主要因素。2.CXCL9對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖、遷移和侵襲能力可能具有重要的促進(jìn)作用。3.CXCL9促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)上調(diào)可能是通過(guò)調(diào)控Akt通路實(shí)現(xiàn)的,而與ERK信號(hào)通路可能沒(méi)有直接關(guān)系。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R714.244
【部分圖文】：

圖 1.1 CXCL9 在正常胎盤及子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)水平（×400 倍）（A：正常胎盤組織；B：子癇前期胎盤組織）3.2.2 Western Blot 檢測(cè)胎盤組織中 CXCL9 蛋白的表達(dá)通過(guò)Western Blot檢測(cè)結(jié)果提示CXCL9在子癇前期胎盤組織中的蛋白表達(dá)明顯低于正常胎盤組織。（見圖 1.2）通過(guò) image J 軟件進(jìn)行蛋白定量分析后，子癇前期組中（0.77±0.07）的蛋白表達(dá)量明顯低于正常妊娠組（1.26±0.03）的表達(dá)，兩者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。（見圖 1.3）NP NP PE PECXCL9 12kDa

XCL9 在正常胎盤及子癇前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表（A：正常胎盤組織；B：子癇前期胎盤組ot 檢測(cè)胎盤組織中 CXCL9 蛋白的表達(dá)n Blot檢測(cè)結(jié)果提示CXCL9在子癇前期胎盤織。（見圖 1.2） J 軟件進(jìn)行蛋白定量分析后，子癇前期組中常妊娠組（1.26±0.03）的表達(dá)，兩者具有顯著NP NP PE PECXCL9 12

圖 1.3 CXCL9 蛋白在正常妊娠和子癇前期胎盤中的表達(dá)，p<0.05（NP：正常妊娠組，n=30 例；PE：子癇前期組，n=30 例）time PCR 檢測(cè)胎盤組織中 CXCL9 mRNA 的表達(dá)eal-time PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，子癇前期胎盤中的 CXCL9 mR9）明顯低于正常妊娠組（2.76±0.27），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）
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本文編號(hào)：2853287