目的:妊娠期高血壓疾病(Hypertensive disorders complicating pregnancy,HDCP)作為產(chǎn)科常見的危及母胎生命的一組疾病,占全部妊娠的5%~10%,可在妊娠期間內(nèi)發(fā)生,也可為原有高血壓在妊娠期的進一步發(fā)展。主要分為:妊娠期高血壓,子癇前期(輕度和重度),子癇,慢性高血壓并發(fā)子癇前期,慢性高血壓合并妊娠。其基本病理生理變化為全身小血管的痙攣、內(nèi)皮的損傷及局部的出血。隨著HDCP與離子通道研究的進展,越來越多的證據(jù)顯示HDCP的發(fā)生發(fā)展與離子通道有一定聯(lián)系,尤其是與鉀通道之間的聯(lián)系最為密切,ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)作為眾多鉀通道中的一種,由結(jié)構(gòu)亞基內(nèi)向整流鉀通道(inwardly rectifying potassium channel,Kir)和調(diào)節(jié)亞基磺酰脲受體(sulphonylurea receptor,SUR)組成,廣泛存在于多種可興奮細胞中。已有研究表明Kir6.1、SUR2B在人類正常妊娠子宮平滑肌細胞中有表達,但KATP通道在病理妊娠如妊娠期高血壓疾病中表達情況研究甚少,故本實驗采用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR experiment,QPCR)和蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測KATP在正常與重度子癇前期孕婦、早發(fā)型重度子癇前期與晚發(fā)型重度子癇前期孕婦、重度子癇前期合并胎兒生長受限與未合并胎兒生長受限孕婦胎盤絨毛膜板動脈(Placental Chorionic plate arteries,CPAs)血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle cell,VSMC)中的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)及蛋白表達水平,分析正常組與重度子癇前期組、晚發(fā)型重度子癇前期組與早發(fā)型重度子癇前期組、重度子癇前期合并胎兒生長受限與未合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中KATP表達的差異及其在病理狀態(tài)下的功能改變,探討CPAs血管平滑肌中KATP通道與重度子癇前期的關(guān)系,為臨床預(yù)防治療提供新思路。方法:(1)選擇本院產(chǎn)科收治的經(jīng)陰道分娩或剖宮產(chǎn)正常孕婦CPAs血管為實驗組,正常孕婦子宮平滑肌為陽性對照組,蒸餾水為空白對照組,樣品充分研磨并提煉出總RNA,反轉(zhuǎn)錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA),半定量PCR法擴增cDNA,電泳擴增產(chǎn)物并成像保存,肉眼直觀對比CPAs血管平滑肌中KATP通道Kir6.1及SUR2B亞基的表達與否。(2)收集本院產(chǎn)科收治的正常孕婦產(chǎn)后胎盤絨毛膜板動脈血管15例,同期重度子癇前期孕婦產(chǎn)后胎盤絨毛膜板動脈血管15例,(1)提煉總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,將甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)設(shè)為參照基因,進行QPCR,得到對應(yīng)Ct值并計算出ΔCt值(目的基因Ct值與內(nèi)參照基因Ct值之差),ΔΔCt值(實驗組基因ΔCt值與對照組基因ΔCt值之差)及2~(-ΔΔCt)值(即表示實驗組基因與對照組基因的比值數(shù)),分析兩組CPAs血管平滑肌中KATP通道Kir6.1及SUR2B亞基mRNA表達量及差異;(2)提取兩組胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌總蛋白,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,轉(zhuǎn)到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉后孵育一抗及二抗,化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像并保存,所得圖像用Fion進行灰度分析,分別與GAPDH內(nèi)參蛋白進行比較,得到目的蛋白的相對表達量及灰度值。QPCR及Western blotting實驗結(jié)果均以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示,以SPSS 19.0進行t檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。(3)收集本院產(chǎn)科終止妊娠的晚發(fā)型重度子癇前期患者胎盤絨毛膜板動脈血管15例,同期終止妊娠的早發(fā)型重度子癇前期患者胎盤絨毛膜板動脈血管15例,以及重度子癇前期合并胎兒生長受限及未合并胎兒生長受限的胎盤絨毛膜板動脈血管各15例,采用同樣的方法進行QPCR及Western blotting實驗,對比分析晚發(fā)型及早發(fā)型重度子癇前期、重度子癇前期合并胎兒生長受限與未合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中KATP通道Kir6.1亞基與SUR2B亞基mRNA及蛋白表達差異。結(jié)果:(1)對于Kir6.1和SUR2B亞基,子宮平滑肌陽性對照組能夠電泳出相應(yīng)條帶,胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌組也能電泳出同樣大小的條帶,蒸餾水組不能電泳出條帶;(2)對比分析正常胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌組及重度子癇前期胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌組,(1)QPCR結(jié)果:15例正常CPAs血管平滑肌中Kir6.1亞基ΔCt值為5.2808±0.34160,15例重度子癇前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1亞基ΔCt值為5.0212±0.45322,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.0890.05);15例正常CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基ΔCt值為3.9898±0.3376,15例重度子癇前期CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基ΔCt值為7.5576±1.4001,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001),計算出其2~(-ΔΔCt)值為0.2091±0.3063,提示重度子癇前期組CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基mRNA水平低于正常組;(2)Western blotting結(jié)果:15例正常CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值為0.7383±0.1781,15例重度子癇前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值為0.7728±0.1060,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.7190.05);15例正常CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值為0.7317±0.0497,15例重度子癇前期CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值為0.4367±0.06327,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。(3)對比分析晚發(fā)型重度子癇前期及早發(fā)型重度子癇前期胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌組,(1)QPCR結(jié)果:15例晚發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1亞基ΔCt值為5.2517±0.4181,15例早發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1亞基ΔCt值為5.0917±0.5105,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.3560.05);15例晚發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基ΔCt值為6.3931±0.4527,15例早發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基ΔCt值為9.9218±0.3897,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001),計算出其2~(-ΔΔCt)值為0.0959±0.0439,提示早發(fā)型重度子癇前期組CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基mRNA水平低于晚發(fā)型重度子癇前期組;(2)Western blotting結(jié)果:15例晚發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值為0.7143±0.07639,15例早發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值為0.6859±0.0924,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.4330.05);15例晚發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值為0.4273±0.05377,15例早發(fā)型重度子癇前期CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值為0.2012±0.03784,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。(4)對比分析重度子癇前期合并胎兒生長受限及未合并胎兒生長受限胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌組,(1)QPCR結(jié)果:15例重度子癇前期合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中Kir6.1亞基ΔCt值為4.7257±0.4392,15例未合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中Kir6.1亞基ΔCt值為4.6794±0.3674,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.7570.05);15例重度子癇前期合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基ΔCt值為9.8608±0.4154,15例未合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基ΔCt值為6.6552±0.4393,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001),計算出其2~(-ΔΔCt)值為0.1125±0.0422,提示重度子癇前期合并胎兒生長受限組CPAs血管平滑肌中SUR2B亞基mRNA水平低于未合并胎兒生長受限組;(2)Western blotting結(jié)果:15例重度子癇前期合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值為0.7889±0.04964,15例未合并胎兒生長受限組CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值為0.7847±0.02936,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.8750.05);15例重度子癇前期合并胎兒生長受限CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值為0.2106±0.0849,15例未合并胎兒生長受限組CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值為0.4004±0.04185,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.001)。結(jié)論:(1)由成像條帶圖可知,CPAs血管平滑肌中存在KATP通道Kir6.1及SUR2B亞基的表達。(2)正常孕婦及重度子癇前期孕婦胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌中KATP通道Kir6.1亞基的mRNA及蛋白表達無明顯區(qū)別,SUR2B亞基在重度子癇前期孕婦中的mRNA及蛋白表達均較正常孕婦降低,提示KATP通道SUR2B亞基的表達水平改變可能與重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。(3)與晚發(fā)型重度子癇前期相比,KATP通道Kir6.1亞基的mRNA及蛋白表達在早發(fā)型重度子癇前期胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌中無明顯差異,而SUR2B亞基的mRNA及蛋白表達均更低,提示重度子癇前期發(fā)生的時間早晚可能與KATP通道SUR2B亞基下降的程度有關(guān)。(4)與重度子癇前期未合并胎兒生長受限相比,KATP通道Kir6.1亞基的mRNA及蛋白表達在重度子癇前期合并胎兒生長受限胎盤絨毛膜板動脈血管平滑肌中無明顯差異,而SUR2B亞基的mRNA及蛋白表達均更低,提示胎兒生長受限可能與KATP通道SUR2B亞基下降的程度有關(guān)。
【學位單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R714.244
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻
英漢縮略詞對照表
致謝
ATP敏感性鉀通道與血管平滑肌關(guān)系及其研究進展（綜述）
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本文編號：2852896