目的:借助生物信息學及相關分析工具,對不同膳食油脂條件(高橄欖油飲食和對照飲食)喂養(yǎng)下的裸鼠宮頸癌轉移瘤組織進行轉錄組測序(RNA-seq)分析,篩出與宮頸癌移植瘤增殖相關的差異表達基因,對這些上調或下調的差異基因進行相關功能注釋分析及通路分析,通過以上這些生信分析結果,對差異表達基因可能的生物功能加以預測。通過相應生物信息學軟件及算法在這些差異表達基因中篩選出核心基因,或是感興趣的目的基因,以期找到能夠解釋高橄欖油飲食促進宮頸癌移植瘤生長的關鍵基因,并對其進行進一步深入研究。方法:第一部分:選取4周齡BALB/c背景的裸鼠,隨機分為對照飲食組(Control Diet,CD)和高橄欖油飲食組(High Olive Oil Diet,OD),并用Hela細胞在裸鼠皮下注射造模。造模6周后收集腫瘤樣本,并進行拍照及測量。并對腫瘤病理切片進行HE和PCNA染色。在體外利用橄欖油中主要成分油酸處理Hela細胞,利用長時間動態(tài)細胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對油酸處理條件下細胞增殖狀態(tài)進行動態(tài)檢測,并利用EdU實驗檢測油酸處理條件下細胞群中進行處于DNA合成狀態(tài)的細胞比例。第二部分:利用高通量轉錄組測序技術篩選對照組和高橄欖油飲食組移植瘤樣本中DEGs(Differentially Expressed Genes),然后用DAVID數(shù)據(jù)庫對上調和下調的基因分別進行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,探索這些差異基因可能的相關的生物學功能及關鍵通路信息。為了進一步挖掘DEGs之間的相互聯(lián)系,應用STRING數(shù)據(jù)庫對差異基因進行蛋白互作網(wǎng)絡(Protein-Protein Interaction,PPI)的構建,并將分析結果數(shù)據(jù)通過Cytoscape軟件將其可視化并利用其CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡中每個節(jié)點(代表一個基因)的網(wǎng)絡拓撲分析(節(jié)點度)進行計算,得到處于PPI網(wǎng)絡中最核心地位的一組樞紐基因(Hub gene),同時用MCODE插件尋找PPI網(wǎng)絡中的重要模塊,根據(jù)設置參數(shù)得到三個重要模塊及其包含的核心蛋白。最后,為驗證轉錄組測序篩選的DEGs準確性,從生信分析得到一組核心基因組中,隨機選取了5個DEGs,采用RT-qPCR方法驗證了它們兩組樣本組織中mRNA表達水平差異。結果:第一部分:裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn)高橄欖油飲食組皮下腫瘤體積及重量均超過對照飲食組6倍(P0.05),同時腫瘤組織HE染色后可見OD組切片呈現(xiàn)更高的異質性,免疫組化分析揭示OD組中PCNA陽性細胞的顯著增加。長時間動態(tài)細胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對Hela細胞增殖狀態(tài)監(jiān)測顯示48h時,油酸處理組細胞融合度為(72.8±1.6)%,較對照組(64.7±5.5)%顯著增高(P0.05),EdU陽性細胞陽性率在油酸處理組為(36.6±1.1)%,較對照組(31.9±1.1)%明顯增加(P0.05)。第二部分:不同膳食脂質喂養(yǎng)條件下兩組腫瘤樣本的轉錄組測序總共得到648個DEGs,其中包括155個上調的DEGs和493個下調的DEGs。GO功能分析和KEGG通路途徑富集分析這些DEGs主要富集在轉錄調控(如EGR1和FOXN2)和細胞增殖(如TGFB2和COL4A3)。用STRING在線蛋白質互作數(shù)據(jù)庫將符合標準的DEGs構建成PPI網(wǎng)絡后,利用Cytoscape的MCODE插件得出三個重要的亞網(wǎng)絡,并且根據(jù)節(jié)點度的大小(節(jié)點度8),由高到低得到15個核心蛋白,并將這15個核心蛋白映射到模塊上,可見相當一部分核心蛋白處于上述的模塊中。通過實時定量PCR分析確認包括JUN,TIMP3,OAS1,OASL和EGR1的中樞基因。RT-qPCR檢測的5個DEGs(JUN,TIMP3,OAS1,OASL和EGR1)的變化趨勢和轉錄組測序結果一致。結論:高橄欖油飲食喂養(yǎng)在體內(nèi)有助于宮頸癌Hela細胞生長,并且油酸在體外可提升其的增殖潛能,隨后全面的生物信息學分析顯示,不同膳食喂養(yǎng)條件下的小鼠移植瘤組織之間存在明顯的基因表達模式差異,這種表達模式差異具體體現(xiàn)在一組重要的核心基因的表達差異及相關信號通路變化,這些核心基因為我們進一步研究宮頸癌潛在的機制提供了的方向,而且它們有望成為宮頸癌診斷和治療潛在的靶點,當然這些核心基因的具體機制我們?nèi)匀恍枰ㄟ^進一步的實驗研究來證明。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

18橄欖油飲食喂養(yǎng)加劇 Hela 宮頸癌細胞裸鼠皮下移植瘤生長。（A）兩組模型小鼠腫瘤拍照圖片（B）6 周皮下瘤測量數(shù)據(jù)繪制生長曲線（C）腫瘤組織重量比較，*Pigure 1 High olive oil diet feeding promotes the growth of xenografts in nude mice. presentative graph of tumours formed by the implantation of HeLa cells under diffes (B) Analysis of tumour growth curves over a 6-week time course (C) Tumour weigdifferent diet groups of nude mice, *P < 0.05.高橄欖油飲食喂養(yǎng)組腫瘤具有更高的異型性和增殖狀態(tài)為了評估不同膳食營養(yǎng)下的腫瘤組織異質性以及腫瘤細胞增殖狀態(tài)，將組織切片進行了 H＆E 染色和免疫組化 PCNA 染色。如圖 2 所示，可見相比，OD 組腫瘤切片呈現(xiàn)出核色素過度增已經(jīng)和細胞核與細胞質比率 OD 組腫瘤更差的分化和更高的異質性（圖 2 A）。同樣，IHC 結果表 PCNA 陽性細胞數(shù)比例顯著增加，提示細胞增殖更活躍（P<0.001，圖

圖 2 高橄欖油飲食下腫瘤呈現(xiàn)更高的異型性和增殖狀態(tài)。（A）腫瘤切片 HE 染色。（B）免疫組化腫瘤組織 PCNA 染色（C）PCNA 染色陽性細胞比例靶圖，***P < 0.001。Figure 2 High olive oil diet feeding group xenograft tissues exhibited poor differentiation,higher heterogeneity and more active proliferation. (A) H&E-stained sections of xenografts (B)Immunohistochemical staining of tumour sectios using an anti-PCNA antibody (C)quantification of the percentage of the PCNA-positive area, ***P < 0.001.2.3 體外實驗油酸促進宮頸癌 Hela 細胞增殖鑒于油酸（Oleic acid, OA）是橄欖油中含量最豐富（超過 70％）、最重要的功能性營養(yǎng)成分，我們在體外實驗中采用 OA 來探索橄欖油對癌細胞功能的調節(jié)作用，實驗分為對照組（Negative Control, NC）和 OA 處理組（OA 濃度為 10μM）。對細胞增殖狀態(tài)的檢測應用了長時間動態(tài)細胞成像系統(tǒng)（Incucyte ZOOM）和 EdU實驗，如圖 3 所示：使用 IncuCyte ZOOM 對兩組細胞增殖狀態(tài)進行近 2 天的動態(tài)觀察，將拍照統(tǒng)計得到的融合度數(shù)據(jù)進行曲線作圖�？梢� 48h 時，OA 組細胞融合

20圖 3 體外實驗油酸促進宮頸癌 Hela 細胞增殖。（A）Incucyte ZOOM 檢測 OA 處理后細胞增殖曲線及 48h 時兩組細胞融合情況拍照。（B）EdU 實驗檢測 DNA 合成情況；EdU 染色（紅色）、細胞核用 Hoechst33342 染色（藍色）；并對 48h 時 EdU 陽性細胞比例進行靶圖定量，*P < 0.05，***P < 0.001。Figure 3 OA accelerates HeLa cell proliferation in vitro. (A) Growth curves for HeLa cellstreated with or without OA were analysed using an IncuCyte incubator microscope and themean confluence values were compared at 48 hrs (B) DNA synthesis of HeLa cells subjected tothe EdU incorporation assay. EdU staining (red). Cell nuclei were stained with Hoechst33342(blue). The quantification of EdU-positive cells was conducted macroscopically and wasexpressed as a percentage relative to the control cells, *P < 0.05, ***P < 0.001.
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本文編號：2847903