研究背景子宮頸癌是威脅婦女生命健康常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,在女性群體最常見(jiàn)診斷的腫瘤中它排第二位,我國(guó)宮頸癌發(fā)病數(shù)量約占全世界總數(shù)的1/3,它已經(jīng)成為導(dǎo)致女性患癌死亡的重要原因,給我國(guó)女性的健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展與人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPVs)的感染密切相關(guān),其中HPV16和HPV18是導(dǎo)致大多數(shù)hpv感染后誘發(fā)宮頸癌癥的兩種主要亞型。其編碼的的早期蛋白E6、E7是導(dǎo)致宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白,它們可以分別抑制P53和降解pRb,使被感染的細(xì)胞無(wú)限增殖并惡變。然而,高危型HPV感染后僅有少數(shù)進(jìn)展為惡性損害,HPVs的感染只是宮頸癌發(fā)生的充分而非必要條件,宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移也不一定依賴于E6、E7的作用,宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。著絲點(diǎn)關(guān)聯(lián)蛋白1(kinetochore associated 1,KNTC1)基因,又稱ROD(rough deal)基因,定位于人12號(hào)染色體,其編碼的蛋白是有絲分裂檢查點(diǎn)的重要組成成分,該蛋白參與多種機(jī)制確保細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中正確的染色體分離。KNTC1在宮頸癌中高表達(dá),提示KNTC1可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,但是它在腫瘤中的作用的還不清楚,有待進(jìn)一步研究。研究目的本課題擬利用細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)初步探究KNTC1在宮頸癌中的表達(dá)情況、對(duì)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制。研究方法1.收集正常宮頸與宮頸癌的新鮮組織標(biāo)本、培養(yǎng)不同宮頸癌細(xì)胞株,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定KNTC1的相對(duì)表達(dá)量,對(duì)比正常宮頸與宮頸癌組織、不同細(xì)胞系之間KNTC1基因的表達(dá)差異;2.利用小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa,敲低KNTC1的表達(dá)后,通過(guò)Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KNTC1對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響;通過(guò)EdU試劑盒、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KNTC1對(duì)細(xì)胞增殖的影響;3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA敲低目的基因后,Western Blot方法檢測(cè)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)記物在蛋白水平的變化;4.沉默HeLa細(xì)胞KNTC1的表達(dá),送檢mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)差異基因表達(dá),結(jié)合KEGG pathway富集分析篩選出可能直接或間接受到KNTC1基因調(diào)控的下游的靶基因,尋找可能的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.qPCR結(jié)果顯示,相較于正常宮頸組織,宮頸癌組織KNTC1表達(dá)量較高且KNTC1在3種宮頸癌細(xì)胞系中均有表達(dá);2.干擾KNTC1表達(dá)后,Transwell結(jié)果顯示KNTC1敲低組的遷移和侵襲能力均明顯增加;EdU、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KNTC1干擾組的增殖能力明顯增強(qiáng)、克隆形成能力顯著增加;3.siRNA抑制KNTC1表達(dá)后,宮頸癌細(xì)胞中上皮性標(biāo)志物ZO1表達(dá)顯著下降,間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin顯著升高;4.mRNA芯片結(jié)果顯示,HeLa細(xì)胞中沉默組與對(duì)照組差異表達(dá)基因與mTOR、TGF-β及同源重組等通路富集程度較高,還需進(jìn)一步篩選研究。結(jié)論KNTC1在宮頸癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),其異常的高表達(dá)對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。KNTC1功能受損會(huì)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖能力,并可能通過(guò)EMT途徑增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

為了驗(yàn)證ＫＮＴＣ１在宮頸癌組織中的表達(dá)水平，首先我們對(duì)從齊魯醫(yī)院收集的１２??例正常宮頸組織和２９例宮頸癌組織提取了總ＲＮＡ，并通過(guò)ｑＰＣＲ檢測(cè)了?ＫＮＴＣ１??基因在兩組ｍＲＮＡ水平上的相對(duì)表達(dá)量的差異（圖１）。通過(guò)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙??向ｔ檢驗(yàn)分析，我們得出結(jié)論：ＫＮＴＣ１在子宮頸腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正??常宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝〇．〇２３１）。??１．２為了進(jìn)一步探究ＫＮＴＣ１是否參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，我們從齊魯醫(yī)??院病例科采集到了與上述２９例宮頸癌組織中對(duì)應(yīng)的２２例患者的臨床病理信息。??根據(jù)組織中ＫＮＴＣ〗的表達(dá)水平，選�。恚遥危料鄬�(duì)表達(dá)量的中位數(shù)（２＿ａａｑ??＝０．８２３４６５８７２９２８２），將其劃分為ＫＮＴＣ１?高、低表達(dá)兩組，隨后利用卡方檢??驗(yàn)分析ＫＮＴＣ１在宮頸癌表達(dá)程度地差異與分化程度、腫瘤大小、組織類型、ＦＩＧＯ??分期、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系（表１）。我們發(fā)現(xiàn)ＫＮＴＣ］在宮頸癌??中表達(dá)的高低與腫瘤大�。埃埃埃埃福┮约傲馨徒Y(jié)的轉(zhuǎn)移（尸＝０．０３０）密切相關(guān)，??而與其他臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性（Ｐ＞〇．〇５）。這一結(jié)果提示ＫＮＴＣ１可能與??宮頸癌的進(jìn)展有關(guān)。??２７??

用ｑＰＣＲ在ｍＲＮＡ水平驗(yàn)證并對(duì)比３種ｓｉＲＮＡ的干擾效率。量化分??析顯示３種ｓｉＲＮＡ序列均可千擾ＳｉＨａ細(xì)胞ＫＮＴＣ１的表達(dá)，ＫＮＴＣｌｉ－２３５６和??ＫＮＴＣｌｉ－５４３１兩組干擾效率均可達(dá)到８０％以上（圖２－Ｂ）。后續(xù)我們則選用??ＫＮＴＣｌｉ－２３５６進(jìn)行細(xì)胞功能及蛋白水平的研究。??Ａ?Ｂ??＿?ＳｉＨａ??Ｉ?０．１５－，?｜?°－２５＇??．２?０．２０－?丁??０１０＇?ｇ－?０．１５－?Ｉ??Ｋ?ｍ??！?丨隱■?＾?０?０５＂?＊＊?＊＊?＂Ｔ＂??髮?〇〇〇丨?ｔ?丨?ｉ?丨丨－ｔ－Ｊ—ｚ?ｏ．ｏｏ－ＬＩ￣ｉ￣￣ｌ－７?１一ｌ—ｉ—??￥?／?Ｚ?ｃ／?，?＾?＾?＾?＾??＾?ｚ?ｚ?ｚ?ｚ??Ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?＾?＾?＾??圖２?ＫＮＴＣ

圖４敲低ＫＮＴＣｌ可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞平板克隆形成??Ａ．ＨｅＬａ和ＳｉＨａ平板克隆染色結(jié)果Ｂ．ＨｅＬａ和ＳｉＨａ細(xì)胞ＮＣ組與ｓｉ組克隆形成數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)??５．下調(diào)ＫＮＴＣ１后，宮頸癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力增強(qiáng)??為了進(jìn)一步驗(yàn)證ＫＮＴＣ１是否參與宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，我們采用??ｓｉＲＮＡ－ＫＮＴＣｌ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使ＨｅＬａ和ＳｉＨａ細(xì)胞中ＫＮＴＣ１表達(dá)沉默。利用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ??小室檢測(cè)對(duì)照組與干擾組細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的差異。結(jié)果表明，干擾組中ＨｅＬａ??和ＳｉＨａ穿過(guò)普通小室及鋪有基質(zhì)膠小室的細(xì)胞明顯多于對(duì)照組（圖５），證明抑??制ＫＮＴＣ１可促進(jìn)ＨｅＬａ和ＳｉＨａ的遷移和浸潤(rùn)。??Ａ?ＮＣ?ｓｉＫＮＴＣＩ?Ｂ?ＮＣ?ｓｉＫＮＴＣＩ??
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