研究背景:子宮內(nèi)膜癌是婦科惡性腫瘤常見的死亡原因之一,子宮內(nèi)膜癌根據(jù)其分子和臨床特征分為兩類。其中,80-90%的子宮內(nèi)膜癌屬于Ⅰ型,包括常見的子宮內(nèi)膜樣腺癌,多發(fā)于絕經(jīng)前婦女,與暴露于過量的雌激素中相關(guān)。通�？稍缙谠\斷,預(yù)后良好。與此相反,Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,約占10-20%,大多數(shù)為漿液性,發(fā)生于老年婦女的萎縮性子宮內(nèi)膜,不依賴于激素。這種組織學(xué)亞型的患者的臨床過程遠比Ⅰ型癌癥要惡性程度高,即使是被診斷為早期疾病的少數(shù)人。對于Ⅱ型癌癥或Ⅰ型晚期子宮內(nèi)膜癌患者的主要治療方案包括化療。順鉑是臨床最常見的治療癌癥的化療藥物,抗癌譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用。但其耐藥性是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因。多藥耐藥是化療中的一個主要問題,30-80%的癌癥患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此,對抗耐藥性對于提供最佳治療至關(guān)重要。在諸多腫瘤多藥耐藥作用機制中,ATP驅(qū)動的結(jié)構(gòu)及功能上的跨膜轉(zhuǎn)運的多為非特異性的細胞抑制劑,從而限制其在細胞內(nèi)達到治療濃度。ATP結(jié)合盒(ABC)超家族成員中的膜轉(zhuǎn)運子在腫瘤細胞中過度表達,也是已知的通過ATP依賴性藥物外排機制的MDR調(diào)節(jié)因子,包括P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)及乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)。各種引起耐藥性的原因可以同時起作用,以多因素方式增加耐藥性。細胞內(nèi)許多具有氧化活性的物質(zhì),如活性氧(ROS),是生物在有氧環(huán)境的代謝產(chǎn)物。研究顯示ROS在諸如細胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)ROS在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。ROS對DNA和蛋白質(zhì)的損害是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的主要原因之一。ROS對DNA和蛋白質(zhì)的損害可以表現(xiàn)為損傷抑癌基因、激活原癌基因,從而誘導(dǎo)細胞的惡性轉(zhuǎn)化。因此,ROS是潛在的致癌物質(zhì)。另一方面,腫瘤細胞經(jīng)常顯示ROS水平明顯增高。氧化應(yīng)激是細胞內(nèi)ROS過度產(chǎn)生和/或細胞抗氧化防御系統(tǒng)功能受損造成的細胞狀態(tài)。腫瘤細胞氧化應(yīng)激的增強能增加DNA和蛋白質(zhì)的異常及腫瘤細胞的血液供應(yīng),加速腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移,加強腫瘤細胞對化療藥物的抵抗。大黃素(Emodin)是中藥大黃的主要有效成分之一,是一種酪氨酸激酶抑制劑,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)Emodin不僅具有抗炎、抗癌的作用,同時能夠抑制不同系統(tǒng)腫瘤細胞的增殖,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,控制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,協(xié)同其他化療藥物的抗癌作用,同時改變了腫瘤細胞的周圍環(huán)境,減少營養(yǎng)物質(zhì)的攝取,破壞細胞膜,從而達到促使腫瘤細胞死亡的結(jié)果。Emodin與現(xiàn)臨床上使用的抗腫瘤藥物及放化療等均具有較好的協(xié)同作用,鑒于Emodin具有抗腫瘤作用且毒性較低,因此,Emodin是應(yīng)用于臨床腫瘤治療的潛在有效藥物。本研究首次探究了 Emodin單獨或者聯(lián)合順鉑對兩型子宮內(nèi)膜癌細胞是否具有抗腫瘤效應(yīng)以及該藥物是否增強順鉑的化療作用及其機制,并在荷瘤裸鼠的體內(nèi)實驗中進一步證實,為子宮內(nèi)膜癌替代治療藥物的研發(fā)提供新思路。第一部分:Emodin對子宮內(nèi)膜癌細胞的抗腫瘤效應(yīng)及細胞內(nèi)ROS水平和耐藥基因表達的影響研究目的:1.檢測Emodin在順鉑對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞生長和凋亡中的作用;2.檢測Emodin和順鉑單獨或者聯(lián)合應(yīng)用后,子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平的變化;3.探究Emodin在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中對耐藥基因表達的影響。研究方法:應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測Emodin和順鉑不同濃度梯度作用于兩種子宮內(nèi)膜癌細胞(Ishikawa細胞和HEC-IB細胞)的生長抑制率,并計算出兩種藥物的IC50濃度;用IC50濃度的Emodin及順鉑單獨及聯(lián)合作用于Ishikawa細胞和HEC-IB細胞,應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細胞的生長增殖情況。應(yīng)用Annexin V/propidide雙染色法檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的凋亡水平,并通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達水平。通過DCFH-DA法檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平,并通過Western blot檢測NADPH氧化酶的表達水平。通過DCFH-DA法檢測H_2O_2預(yù)處理后的Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平的變化。通過實時RT-PCR檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因Pgp、MRP1及BCRP的表達,并通過Western blot檢測耐藥基因Pgp、MRP1及BCRP蛋白的表達。通過實時RT-PCR檢測H_2O_2預(yù)處理后的Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因Pgp、MRP1及BCRP的表達。通過實時RT-PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染前后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因Pgp、MRP1及BCRP的表達變化,并通過Annexin V/propidide雙染色法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的凋亡水平。研究結(jié)果:1.Emodin和順鉑作用于Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的生長抑制作用及增殖能力的影響:應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測Emodin和順鉑不同濃度梯度作用于Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的生長抑制作用。結(jié)果顯示:Emodin和順鉑明顯抑制了細胞的生長,并得出Emodin半抑制濃度IC50濃度為10 μmol/L,順鉑并得出Emodin IC50濃度為10 μmol/L,順鉑IC50濃度為1μg/mL。IC50濃度為1μ g/mL。應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測IC50濃度的Emodin及順鉑單獨及聯(lián)合作用后的細胞增殖率,結(jié)果顯示:Emodin及順鉑單獨及聯(lián)合作用明顯抑制了 Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的增殖水平,這種抑制作用具有時間依賴性,并且兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時抑制作用尤為顯著,尤其對Ishikawa細胞的抑制作用更為明顯。2.Emodin和順鉑對于Ishikawa細胞和HEC-IB細胞凋亡的影響:應(yīng)用Annexin V/propidide雙染色法檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的凋亡水平的影響。結(jié)果顯示:Emodin和順鉑明顯促進Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的凋亡,兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時尤其顯著。并通過Western blot檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達水平,結(jié)果顯示:caspase-3的表達水平明顯升高,兩藥聯(lián)用時升高更加顯著。并且聯(lián)合應(yīng)用對于Ishikawa細胞的凋亡作用更加顯著。3.Emodin和順鉑可降低子宮內(nèi)膜癌細胞中ROS水平:通過DCFH-DA法檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平的影響,結(jié)果顯示:Emodin及順鉑降低了 Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平,兩藥聯(lián)用時作用更加顯著。并通過Western blot檢測NADPH氧化酶的表達水平,結(jié)果顯示:Emmodin及順鉑聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制NADPH氧化酶的表達。兩種細胞之間無明顯差異。4.H_2O_2對Emodin和順鉑作用后的子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)的ROS水平的影響:通過DCFH-DA法檢測H_2O_2預(yù)處理后的Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平的變化,結(jié)果顯示:H_2O_2處理后,之前Emodin與順鉑聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致的ROS水平的下降,又表現(xiàn)為升高。兩種細胞之間無明顯差異。5.Emodin和順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞的耐藥基因表達的影響:通過實時RT-PCR檢測Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP的表達,并通過Western blot檢測耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP蛋白的表達,結(jié)果顯示:耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP的表達及其蛋白的表達均明顯下降,兩藥聯(lián)用時尤其顯著,并且聯(lián)合處理對Ishikawa細胞中P-gp和BCRP蛋白水平的抑制作用更為明顯。6.H_2O_2作用后的子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)耐藥基因表達的影響:通過RT-PCR檢測H_2O_2預(yù)處理后的Emodin及順鉑單獨及兩藥聯(lián)合應(yīng)用后Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP的表達,結(jié)果顯示:兩種細胞中耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP的表達均較前升高。這提示我們子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)耐藥基因的表達水平可能與ROS水平相關(guān)。7.抑制耐藥基因的表達對子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡的影響:通過siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP,RT-PCR檢測基因水平變化,結(jié)果顯示:耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP水平均較轉(zhuǎn)染前明顯下降。通過Annexin V/propidide雙染色法檢測siRNA轉(zhuǎn)染基因后Emodin作用的Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的凋亡水平,結(jié)果顯示:即使不聯(lián)合使用順鉑,基因的表達下調(diào)也能顯著提高Ishikawa細胞和HEC-IB細胞的凋亡水平。研究結(jié)論:1.Emodin可增強順鉑對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞生長抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用;降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞內(nèi)ROS水平的作用;2.Emodin和順鉑聯(lián)合使用可顯著降低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞中耐藥基因P-gp、MRP1及BCRP的表達及其蛋白的表達,增加順鉑的化療敏感性;3.Emodin和順鉑聯(lián)合用藥對Ishikawa細胞的生長抑制作用、促凋亡作用以及對耐藥基因表達的抑制作用更加顯著。第二部分 Emodin對子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤的治療作用研究研究目的:構(gòu)建人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型,探討Emodin對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)。研究方法:Emodin與順鉑分別單獨或者聯(lián)合處理后的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞,制成密度為1X 105的細胞懸液,通過皮下注射注入裸鼠的右前腿。建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型;分組分為對照組、Emodin單藥組、順鉑單藥組、Emodin和順鉑聯(lián)合給藥組四個組別。接種40天后,使用游標卡尺測量各組裸鼠皮下移植瘤的長短徑并計算腫瘤體積。記錄并計算小鼠的生存時間。研究結(jié)果:1.子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和HEC-IB細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立:對照組Ishikawa細胞和HEC-IB細胞接種至裸鼠皮下,接種后接種部位可觸及米粒大小結(jié)節(jié),質(zhì)韌,成瘤率100%。荷瘤裸鼠的一般狀況良好,皮下移植瘤生長迅速。接種40天后,藥物組各組裸鼠對藥物耐受良好。2.Emodin和順鉑對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響:與未處理的對照組相比,單獨使用Emmodin或順鉑處理,可使腫瘤體積減小,可是裸鼠的生存時間延長,兩藥聯(lián)合給藥組這些作用更加顯著。結(jié)論:Emodin對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤生長有抑制作用,并對順鉑抑制腫瘤生長有協(xié)同作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

圖１?Ｅｍｏｄｉｒｉ提髙了順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞系生長的抑制作用??

圖２?Ｅｍｏｄｉｎ通過增強子宮內(nèi)膜癌細胞系的凋亡而提高化療敏感性??

圖３?Ｅｍｏｄｉｎ抑制子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)的ＲＯＳ水平??
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本文編號：2843941