目的:我們前期發(fā)現(xiàn)TRPM7(Transient receptor potential melastatin 7)可促進上皮性卵巢癌細胞侵襲遷移,但其機制尚未闡明。本研究旨在探討TRPM7通過[Ca~(2+)]i-PI3K/AKT信號軸調控上皮性卵巢癌細胞EMT,進而影響上皮性卵巢癌侵襲轉移的作用與分子機制,為上皮性卵巢癌抗轉移治療提供新的分子靶標和新策略。方法:本研究分別在SKOV3及OVCAR3中建立穩(wěn)定沉默TRPM7表達的上皮性卵巢癌細胞系,采用劃痕、Transwell侵襲遷移實驗、尾靜脈注射裸鼠肺轉移瘤實驗等方法在體內外考察TRPM7對上皮性卵巢癌細胞侵襲和遷移能力的影響,通過形態(tài)學觀察、流式細胞分析術、Western Blot、qRT-PCR等方法考察TRPM7表達改變,或同時抑制胞內鈣信號,或給予PI3K/AKT激活劑/抑制劑處理對上皮性卵巢癌細胞EMT相關標志物及鈣信號的影響,以及PI3K/AKT信號通路分子表達的影響。結果:1.本研究成功構建了TRPM7穩(wěn)定沉默的上皮性卵巢癌細胞株。體內、體外顯示沉默TRPM7表達后,上皮性卵巢癌細胞的侵襲轉移能力明顯減弱、EMT改變顯著被抑制;使用Fluo-8-AM標記鈣離子,激光共聚焦及流式細胞檢測技術發(fā)現(xiàn),沉默TRPM7表達可明顯減弱細胞內的鈣信號。2.本研究使用激光共聚焦及流式細胞檢測技術發(fā)現(xiàn)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可以有效阻斷SKOV3及OVCAR3細胞內的鈣信號,并抑制上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移。SKOV3及OVCAR3細胞給予BAPTA-AM處理的同時,分別激活或抑制PI3K/AKT信號通路,侵襲遷移實驗結果顯示抑制(激活)PI3K/AKT信號通路對其分別具有增強(抵消)作用,提示鈣信號可以通過PI3K/AKT通路影響上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移。3.本研究通過BAPTA-AM阻斷TRPM7穩(wěn)定沉默的上皮性卵巢癌細胞中的鈣信號,增強TRPM7沉默對上皮性卵巢癌細胞侵襲遷移的抑制作用。4.體內、體外實驗顯示沉默TRPM7表達可以通過[Ca~(2+)]i影響PI3K介導Akt磷酸化,進而抑制上皮性卵巢癌細胞EMT。結論:1.[Ca~(2+)]i可通過激活PI3K/AKT通路促進上皮性卵巢癌細胞EMT、侵襲轉移。2.沉默TRPM7可通過抑制[Ca~(2+)]i-PI3K/AKT信號通路介導的EMT,進而抑制上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移。
【學位單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

圖 1.1 TRPM7 結構，同腫瘤的增殖、遷移、侵襲和轉移有關既往的研究表明，TRPM7 在上皮性卵巢癌組織及細胞中性卵巢癌組織中，其表達水平與上皮性卵巢癌患者盆腔淋正相關[18,19]。因此，本研究將從體內及體外實驗探究“T平來激活 PI3K / AKT 信號傳導，進而調節(jié)上皮性卵巢癌皮性卵巢癌的侵襲與轉移”的作用。本研究目的為探索：癌細胞[Ca2+]i、EMT 及侵襲轉移的作用；2.鈣信號與上皮襲轉移能力的關系；3.TRPM7 通過鈣信號介導上皮性卵移的機制探索。本研究旨在為上皮性卵巢癌的侵襲轉移的思路和策略。

南華大學碩士學位論文30圖3.1 穩(wěn)定干擾TRPM7上皮性卵巢癌細胞系驗證（A）Western blot 實驗（以GAPDH作為內參）分析TRPM7在正常卵巢上皮和EOC細胞中的蛋白表達水平；（B）QRT-PCR實驗（以GAPDH作為內參）分析TRPM7在穩(wěn)轉SKOV3和OVCAR3細胞中mRNA表達下降水平；（C） Western blot 實驗（以GAPDH作為內參）分析TRPM7在穩(wěn)轉SKOV3和OVCAR3細胞中蛋白表達下降水平。（所有數(shù)據(jù)均來自3次獨立重復試驗，結果均用均值±標準差（SD）表示，組間采用t檢驗）3.1.2 沉默 TRPM7 對上皮性卵巢癌細胞遷移能力的影響本研究通過Transwell遷移實驗觀察沉默TRPM7表達后上皮性卵巢癌細胞遷移能力的變化。細胞遷移實驗結果發(fā)現(xiàn)：在SKOV3細胞中， sh-control-SKOV3組48h后穿過小室膜到達下室面的細胞個數(shù)為176±12.64、而sh-TRPM7-SKOV3組穿過的細胞數(shù)明顯減少，為30±11.42，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在OVCAR3細胞中，得到了相類似的結果，即sh-control-OVCAR3組穿膜細胞數(shù)為163±10.21、sh-TRPM7-OVCAR3組為50±10.17，sh-TRPM7-OVCAR3組穿膜細胞數(shù)明顯減少

細胞實驗結果與前者類似，即sh-control-OVCAR3和sh-TRPM7-OVCAR3劃痕48h后細胞遷移率分別為60.32±3.51%和30.34±4.14%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。以上結果同樣說明，沉默TRPM7可抑制上皮性卵巢癌上皮細胞遷移（圖3.2B）。圖3.2 沉默TRPM7表達對上皮性卵巢癌細胞遷移能力的影響在上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3細胞中沉默TRPM7后，行（A）Transwell遷移實驗；（B）劃痕實驗。（所有數(shù)據(jù)均來自3次獨立重復試驗，結果均用均值±標準差（SD）表示，組間采用t檢驗）3.1.3 沉默 TRPM7 對上皮性卵巢癌細胞侵襲能力的影響本研究通過Transwell侵襲實驗觀察沉默TRPM7表達對上皮性卵巢癌細胞侵襲 能 力 的 影 響 。 結 果 發(fā) 現(xiàn) ： 在 SKOV3 細 胞 中 sh-control-SKOV3 及sh-TRPM7-SKOV348h后穿過基質膠及小室膜到達下室面的細胞個數(shù)分別是：183±11.34、32±12.12，即干擾組明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在OVCAR3細胞中也發(fā)現(xiàn)，sh-control-OVCAR348h后穿過基質膠及小室膜到達下室面的細胞個數(shù)是156±11.12，sh-TRPM7- OVCAR3數(shù)目明顯減少，為20±12.13
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本文編號：2843288