研究目的:宮內(nèi)生長遲緩(Intrauterine Growth Restriction,IUGR),表現(xiàn)為胎兒未能達到其遺傳因素影響下的應(yīng)有大小,是胚胎發(fā)育異常最常見的形式。動物實驗研究和流行病學(xué)調(diào)查都認為IUGR會增加成年期發(fā)生肥胖、冠心病、2型糖尿病和糖耐量異常等代謝綜合征(Metabolic Syndrome,MS)的風(fēng)險。然而迄今為止,IUGR引起代謝綜合征的機制尚未闡明。近年來,表觀遺傳學(xué)的迅猛發(fā)展,各項試驗手段的不斷進步,為人們從表觀遺傳學(xué)角度探索IUGR引起成年期代謝綜合征的機制提供了可能。DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要方式之一,主要發(fā)生在CpG島,能夠?qū)I養(yǎng)、發(fā)育、環(huán)境等不同的信號做出反應(yīng),參與完成細胞的時序調(diào)控和適應(yīng)調(diào)控。DNA甲基化芯片技術(shù)和檢測單個基因DNA甲基化的各種方法,為從整體基因組DNA甲基化和易感基因的DNA甲基化進行研究提供了技術(shù)平臺。研究顯示,IUGR新生兒表現(xiàn)為低血糖和低胰島素血癥,胰腺β細胞發(fā)育不良,功能障礙。胰腺β細胞的發(fā)育是一個由多因素共同參與的復(fù)雜過程,DNA甲基化是體內(nèi)極為重要的基因內(nèi)源修飾作用。本研究通過孕期全程低蛋白飲食法建立IUGR大鼠動物模型,觀察IUGR大鼠不同時間點各項指標的變化規(guī)律,通過DNA甲基化芯片檢測正常和IUGR新生鼠胰島全基因組的DNA甲基化狀態(tài),篩選出差異性DNA甲基化位點,結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果最終確定候選位點。采用單個基因甲基化位點檢測方法檢測候選差異性DNA甲基化位點,并且檢測其相對應(yīng)基因mRNA水平的表達情況。本研究通過研究DNA甲基化在IUGR大鼠胰島生長發(fā)育過程中的變化規(guī)律,旨在揭示DNA甲基化與IUGR的內(nèi)在聯(lián)系,為IUGR引發(fā)代謝綜合征的機制研究提供新的線索。研究方法:運用孕期全程低蛋白飲食法建立IUGR大鼠動物模型,確認已受孕的SPF級健康Wistar雌鼠(體重230~280g)48只(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供)。按照喂養(yǎng)飼料(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供)不同隨機分成兩組:標準飼料飲食組(n=24),蛋白含量23%,喂養(yǎng)至分娩得到正常子鼠,此為正常對照組(CON組);孕期全程低蛋白飲食(n=24),蛋白含量8%,喂養(yǎng)至分娩,取出生體重低于正常對照組子鼠平均體重2個標準差以下的為IUGR鼠,記為IUGR組。選擇研究的時間點分別為D1、3W、12W和10M。選取雄鼠做為研究對象,每個時間點均選6只,分別來自6窩。采用外消化方法提取D1大鼠胰島,內(nèi)消化方法提取其他三個時間點的大鼠胰島。采用雙硫蹤染色的方法鑒定胰島。觀察D1、3W、12W和10M各組大鼠的體重、胰腺重量、胰島大小和數(shù)量、胰腺β細胞數(shù)量和體積變化情況,檢測各時間點各組大鼠血糖和胰島素水平。10M大鼠行正糖-高胰島素鉗夾實驗以明確IUGR老年鼠是否存在胰島素抵抗。MeDIP-chip篩選IUGR新生鼠啟動子區(qū)差異性DNA甲基化位點:CON組和IUGR組D1大鼠胰島各3例(分別來自3窩),采用DNeasy血和組織試劑盒(Qiagen,德國)提取純化胰島全基因組總DNA,超聲碎裂成長度為~200-1000bp的片段DNA,以單克隆抗5’-甲基化胞嘧啶(5mC)抗體(Diagenode,比利時)做為抗體行免疫共沉淀,富集甲基化的片段DNA,全基因組擴增試劑盒(Sigma-Aldrich,USA)進行片段DNA的線性擴增,快速PCR純化試劑盒(Qiagen,德國)純化擴增后的DNA,NimbleGen雙色DNA標記試劑盒(Roche,USA)以Cy3和Cy5標記片段DNA,最后與甲基化芯片NimbleGen Rat DNA Methylation3×720K Promoter Plus CpG Island Array(Roche)進行雜交反應(yīng)。選用Nimble Scan v2.5分析軟件對芯片的結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析,對芯片發(fā)現(xiàn)的差異性DNA甲基化位點進行Gene Ontology分析和KEGG通路分析。胰腺發(fā)育相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫篩選候選DNA甲基化位點:2013-03-28在PubMed數(shù)據(jù)庫中以“pancreas/growth and development”[mesh],限定specials:other animals為檢索式。下載Medline格式的abstract(.txt)格式文獻條目信息,將文獻條目信息輸入MetaMap,將其處理結(jié)果輸入MetaMap數(shù)據(jù)處理軟件(閆雷,中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)信息系),對其結(jié)果進行篩查,建立共現(xiàn)矩陣,UCINET處理數(shù)據(jù),最后得到胰腺發(fā)育相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫。將芯片發(fā)現(xiàn)的差異性DNA甲基化位點相對應(yīng)的基因輸入到胰腺發(fā)育相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中,再次篩選最終得到候選的差異性DNA甲基化位點,再結(jié)合Gene Ontology分析和KEGG通路分析的分析結(jié)果,最終確定Pax6、Pde3b、Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1和Dnmt3a共6個位點做為候選DNA甲基化位點。首先,通過MeDIP-real time PCR方法檢測這6個位點在IUGR和正常新生鼠胰島啟動子區(qū)DNA甲基化水平的變化情況用以驗證芯片結(jié)果。接著,通過檢測上述6個位點在10M時正常組和IUGR組大鼠胰島啟動子區(qū)DNA甲基化水平,以明確IUGR老年大鼠胰島中這6個基因的DNA甲基化水平變化情況。采用real time PCR方法檢測6個候選基因mRNA在D1和10M正常組和IUGR組大鼠胰島的表達情況。最后,通過免疫熒光雙染法和Western blot方法檢測胰腺發(fā)育關(guān)鍵基因Nkx2.2和Nkx6.1在正常和IUGR新生鼠和10M大鼠胰腺的蛋白表達情況。結(jié)果:1.通過孕期全程低蛋白飲食法成功建立IUGR大鼠動物模型,新生鼠IUGR組體重明顯低于CON組,IUGR組10M大鼠體重高于CON組(P0.05)。IUGR組胰腺重量在D1、3W和12W這三個時間點均低于CON組(P0.05)。10M時IUGR組胰腺重量高于CON組(P0.05)。胰腺重量/體重比值IUGR組D1和12W明顯低于CON組(P0.05)。10M時胰腺重量/體重比值高于CON組(P0.05)。子鼠胰島大小,IUGR組D1和12W均低于CON組(P0.05)。子鼠胰島數(shù)量,IUGR組D1和12W均低于CON組(P0.05)。IUGR大鼠胰腺β細胞分數(shù)和β細胞團體積在D1、12W和10M時IUGR組均低于CON組(P0.05)。12W和10M時,IUGR大鼠空腹血糖較CON組偏高,血清胰島素水平升高(P0.05)。兩組10M大鼠進行正糖-高胰島素鉗夾實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)60min和120 min時IUGR大鼠胰島素分泌水平明顯高于CON組(P0.05)。IUGR組穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率(SSGIR)顯著低于CON組(P0.05),表明IUGR老年大鼠發(fā)生外周組織胰島素抵抗。2.通過MeDIP-chip對IUGR和正常新生鼠胰島進行了高通量DNA甲基化水平的檢測,篩選出254個啟動子區(qū)差異性甲基化位點,其中,157個高甲基化位點(61.81%),97個低甲基化位點(38.19%)。在所有啟動子區(qū)差異性甲基化位點中,HCP位居首位(102/254,40.12%),LCP居次位(90/254,35.43%)。373個差異性甲基化CpG島包括110個低甲基化CpG島(29.49%)和263個高甲基化CpG島(70.51%)。在所有差異性甲基化CpG島中,啟動子區(qū)173個(46.38%),基因間165個(44.24%)。在所有差異性甲基化CpG島中,227個有相對應(yīng)基因(60.86%),146個尚無對應(yīng)的基因(39.14%)。對254個啟動子區(qū)DNA甲基化差異性位點所對應(yīng)的基因進行Gene Ontology(GO)分析和KEGG通路分析。通過文本挖掘建立的胰腺發(fā)育相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫,包含220個胰腺發(fā)育相關(guān)基因。將DNA甲基化芯片篩選出的254個差異性DNA甲基化位點,輸入到胰腺發(fā)育相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫,再次篩選,結(jié)合功能分析結(jié)果,最終確定Pax6、Pde3b、Pdx1、Nkx2.2、Nkx6.1和Dnmt3a共6個位點做為候選位點。3.通過MeDIP-real time PCR方法檢測單個基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平,與正常組相比,在IUGR新生鼠胰島中,Pde3b和Dnmt3a啟動子區(qū)DNA高甲基化,Pax6啟動子區(qū)DNA低甲基化,Pdx1、Nkx2.2和Nkx6.1啟動子區(qū)DNA甲基化水平無變化。以上結(jié)果與DNA甲基化芯片結(jié)果一致。除Pax6 mRNA表達上調(diào)外,余5個基因mRNA表達水平均降低。這種變化同樣發(fā)生在IUGR老年大鼠胰島。Nkx2.2和Nkx6.1在IUGR新生鼠胰島的表達下調(diào),在IUGR老年鼠胰島表達缺如。結(jié)論:1.宮內(nèi)蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良導(dǎo)致大鼠IUGR發(fā)生率明顯增高。IUGR大鼠胰島發(fā)育受損,功能減退,隨年齡增長至老年時出現(xiàn)代謝綜合征。2.IUGR新生鼠胰島發(fā)生整體水平DNA甲基化異常改變,胰腺發(fā)育關(guān)鍵基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平在新生鼠和老年鼠胰島中發(fā)生異常改變,影響基因轉(zhuǎn)錄。表明宮內(nèi)蛋白營養(yǎng)不良可能導(dǎo)致IUGR大鼠胰島DNA甲基化異常改變,繼而引起基因表達改變,影響胰腺發(fā)育和功能,最終導(dǎo)致代謝綜合征。IUGR老年大鼠代謝綜合征是生命早期的環(huán)境因素印跡的“程序化”結(jié)果。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R714.51
【部分圖文】：

8圖 1.2 不同時間點兩組大鼠體重變化情況 D1，IUGR 組大鼠體重明顯低UGR 組大鼠體重明顯高于 CON 組。注：*P<0.05。胰腺外觀見圖 1.3。子鼠胰腺重量（pancreas weight，PW），在 D三個時間點均低于 CON 組（P<0.05）。10M 時 IUGR 組胰腺重量5.93 ±0.44 g vs 5.13 ±0.29 g，P<0.05）。見圖 1.4A。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文IUGR 組大鼠出生體重（body weight，BW）明顯低于 CON 組（4.36.45 ±0.72 g，P<0.05）。新生鼠外觀圖見圖 1.1A。自哺乳期始，IUGR長追趕，3W 和 12W 時，IUGR 組大鼠體重與 CON 組相較，無統(tǒng)計學(xué)大鼠外觀圖見圖 1.1B。10M 時 IUGR 組體重已明顯超過 CON 組（798vs 747.67 ±39.02 g，P<0.05）。見圖 1.2。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文胰腺重量/體重比值（pancreas weight/body weight ratio，PW和 12W 明顯低于 CON 組（D1：2.24 ±0.09 % vs 2.59 ±0.11 %；.87 ±0.45 %，P<0.05）。10M 時胰腺重量/體重比值明顯高于 CO.86 ±0.52 %，P<0.05）。見圖 1.4 B。.3 （A）大鼠胰腺外觀（在體）;（B）膨脹的大鼠胰腺外觀（注入胰BA
【參考文獻】

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1 宋煥瑾;薛武軍;李楊;宋勇;田曉輝;丁小明;馮新順;;聯(lián)合應(yīng)用大鼠血管內(nèi)皮細胞和胰島培養(yǎng)對胰島功能的影響[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2011年01期

本文編號：2837225