研究背景：卵巢癌是女性系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,其中上皮性卵巢癌是最常見的組織學(xué)類型,占卵巢惡性腫瘤的85%-90%。由于卵巢位于盆腔深部,發(fā)病隱匿,早期癥狀不典型,缺乏有效的早期診斷方法,臨床初診患者70-80%己屬中晚期。近年來,雖然腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和各種化療方法有了迅速發(fā)展,但其5年生存率無明顯改善,仍徘徊在30-40%,已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅婦女健康的主要腫瘤,死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。因此,研究卵巢癌發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制,從分子水平揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程,研發(fā)早期診斷技術(shù)以及探索新的藥物治療靶點(diǎn)是目前的研究熱點(diǎn)。近年來,隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展,人們逐步認(rèn)識(shí)到表觀遺傳學(xué)的改變和遺傳學(xué)的改變一樣共同參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,腫瘤不僅是遺傳學(xué)疾病,同時(shí)也是表觀遺傳學(xué)疾病。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的主要修飾形式,是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下,甲基被動(dòng)的增添在胞嘧啶上,生成5-甲基胞嘧啶的過程,是目前表觀遺傳學(xué)中研究最多、最深入的領(lǐng)域。DNA的異常甲基化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而且是腫瘤中的早期、頻發(fā)事件。研究證實(shí)基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要機(jī)制,在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機(jī)制。惡性腫瘤患者外周血中游離DNA含量明顯高于正常健康人,而且具備與原發(fā)腫瘤組織一致的惡性細(xì)胞生物學(xué)行為,因此分析外周血中游離DNA的甲基化狀態(tài),可以反映實(shí)體腫瘤的甲基化水平,對(duì)于惡性腫瘤的早期診斷極具臨床應(yīng)用價(jià)值,可作為一種潛在的無創(chuàng)性腫瘤標(biāo)志物。DNA甲基化具有可逆性,甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)抑癌基因的高甲基化狀態(tài),使之重新表達(dá),從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的,是目前腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。5-氮雜2’-脫氧胞苷(5-aza-dC)是目前最為常見的核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲。Ras通過和不同的效應(yīng)分子結(jié)合來調(diào)節(jié)不同的生命活動(dòng),既能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,又能抑制生長(zhǎng),如促進(jìn)凋亡,細(xì)胞周期阻滯等。Ras的負(fù)效應(yīng)調(diào)節(jié)因子參與了Ras的生長(zhǎng)抑制作用,其中研究最多的是RASSF家族。目前為止,共發(fā)現(xiàn)這個(gè)家族有10個(gè)成員(RASSF1-10)。大量研究已證實(shí)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活是腫瘤癌變過程中的頻發(fā)事件,其參與了包括卵巢癌在內(nèi)的多種實(shí)性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,是上皮性卵巢癌中最常見的甲基化抑癌基因,可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學(xué)指標(biāo)。與RASSF 1A具有高度同源性的RASSF2A在結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌中表達(dá)降低或缺失與其甲基化有關(guān)。RASSF2A基因作為Ras的下游效應(yīng)物,在Ras激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,扮演抑癌基因的角色。但有關(guān)RASSF2A基因與卵巢癌的關(guān)系尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用甲基化特異性PCR檢測(cè)上皮性卵巢癌組織及其相對(duì)應(yīng)的血清標(biāo)本中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),RT-PCR檢測(cè)RASSF2A mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)情況,分析RASSF2A啟動(dòng)子異常甲基化與其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相關(guān)性,甲基化狀態(tài)在兩種組織標(biāo)本中的相關(guān)性,以及RASSF2A啟動(dòng)子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征(年齡、病理類型、臨床分期、組織分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。并使用去甲基化試劑5-aza-dC作用于卵巢癌細(xì)胞系SKOV3,分析去甲基化作用前后RASSF2A表達(dá)水平、甲基化狀態(tài)的改變,以及對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,探討RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制,血清RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢癌早期診斷中的價(jià)值,初步探索并尋找治療卵巢癌的新靶點(diǎn)。第一部分卵巢癌組織中RASSF2A基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其甲基化狀態(tài)的檢測(cè)目的：檢測(cè)上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其nRNA表達(dá)情況,分析RASSF2A基因啟動(dòng)子異常甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相關(guān)性,及其與卵巢癌患者年齡、病理類型、臨床分期、組織分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系,初步探討RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化水平與其表達(dá)缺失之間的關(guān)系,研究RASSF2A基因在上皮性卵巢癌中的作用機(jī)制。方法：本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中RASSF2A基因mRNA表達(dá)情況,同時(shí)采用甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)方法檢測(cè)不同組織中RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果：1.RASSF2AmRNA在三組卵巢組織中的表達(dá)RASSF?AmRNA在正常卵巢及良性卵巢腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90%(9/10)、85.7%(12/14),而在卵巢癌組織中RASSF2A的表達(dá)率明顯下降,僅為42.6%(20/47)。三組中RASSF2A mRNA的表達(dá)存在顯著性差異(x2=13.198,p=0.001)。三組中兩兩比較,卵巢癌組與良性卵巢腫瘤組,卵巢癌組與正常卵巢組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.057,p=0.005；x2=7.427,p=0.006),良性卵巢腫瘤組與正常卵巢組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.098,p=0.754)。2.三組卵巢組織中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)卵巢癌組織中有51.1%(24/47)的組織存在RASSF2A甲基化,而在良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中均未檢測(cè)到此現(xiàn)象。卵巢癌組織中RASSF2A甲基化陽(yáng)性率明顯高于良性卵巢腫瘤、正常卵巢組織(x2=18.513,p=0.001),差異具有顯著性。3.RASSF2A啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)及卵巢癌的關(guān)系在卵巢癌組織中,RASSF2A甲基化陰性的組織中其mRNA的表達(dá)率較高,為82.6%(19/23),而在RASSF2A甲基化陽(yáng)性的組織中其mRNA的表達(dá)明顯下降,僅為33.3%(8/24),差異具有顯著性(x2=11.665,r=-0.498,p=0.001)。RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移之間無明顯的相關(guān)性。但隨著患者年齡的增加,RASSF2A甲基化有升高趨勢(shì)。結(jié)論：1.RASSF2AmRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯低于正常卵巢和良性卵巢腫瘤組織,呈低表達(dá)或表達(dá)缺失。2. RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是卵巢癌中的頻發(fā)事件,是卵巢癌中作為抑癌基因的RASSF2A失活的重要原因之一。3. RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)錄沉默在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。第二部分卵巢癌患者血清標(biāo)本中RASSF2A基因甲基化水平及臨床意義目的：檢測(cè)上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織相配對(duì)的血清標(biāo)本中RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),并分析其與卵巢癌患者年齡、病理類型、臨床分期、組織分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系,初步探討檢測(cè)血清RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢癌診斷中的作用。方法：本研究采用MSP方法檢測(cè)第一部分實(shí)驗(yàn)中卵巢組織相對(duì)應(yīng)的血清標(biāo)本中RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果：1.三組血清標(biāo)本中RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)卵巢癌組血清中36.2%(17/47)的標(biāo)本存在RASSF2A甲基化,而在良性卵巢腫瘤組及正常卵巢組中均未檢測(cè)到此現(xiàn)象。卵巢癌組血清標(biāo)本RASSF2A甲基化陽(yáng)性率明顯高于良性卵巢腫瘤組、正常卵巢組(x2=11.414,p=0.003),差異具有顯著性。2. RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在血清標(biāo)本與組織標(biāo)本中的關(guān)系結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在發(fā)生RASSF2A甲基化的24例組織標(biāo)本中,其對(duì)應(yīng)的血清標(biāo)本中有17例亦發(fā)生了甲基化；在未發(fā)生基因甲基化的23例組織標(biāo)本中,其對(duì)應(yīng)的血清標(biāo)本也未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。兩者有明顯的相關(guān)性,差異具有顯著性(x2=25.524,r=0.737,p=0.000)。3.血清標(biāo)本中RASSF2A甲基化水平與臨床特征的關(guān)系血清標(biāo)本中RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的臨床病理特征之間無明顯的相關(guān)性。結(jié)論：1.血清標(biāo)本中RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化具有腫瘤特異性,是卵巢癌中的早期、頻發(fā)事件。2.血清標(biāo)本中RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)可以間接反應(yīng)原發(fā)腫瘤DNA甲基化水平,是原發(fā)腫瘤的有效參考指標(biāo)。3.檢測(cè)血清標(biāo)本中RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平可作為卵巢癌的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物,有助于卵巢癌的早期診斷。第三部分5-aza-dC對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化及其表達(dá)的影響目的：本研究使用去甲基化試劑5-aza-dC作用于卵巢癌細(xì)胞系SKOV3,分析去甲基化作用前后RASSF2A基因甲基化及其表達(dá)水平的改變,以及SKOV3細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,初步探討并尋找治療卵巢癌的新靶點(diǎn)。方法：本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)5-aza-dC作用前后卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表達(dá)水平；MSP方法檢測(cè)其甲基化狀態(tài)的改變；MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果：1.去甲基化試劑對(duì)SKOV3中RASSF2A基因表達(dá)的影響5-aza-dC作用后使卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表達(dá)水平明顯增高。2.去甲基化試劑對(duì)SKOV3中RASSF2A啟動(dòng)子甲基化的影響5-aza-dC作用后使卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化水平下降。3.去甲基化試劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響5-aza-dC藥物干預(yù)后,SKOV3細(xì)胞活性和抗凋亡能力均明顯下降。結(jié)論：1.去甲基化試劑5-aza-dC可使RASSF2A表達(dá)升高或重新表達(dá),提示基因甲基化是導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞中RASSF2A低表達(dá)或表達(dá)缺失的原因之一。2.去甲基化試劑5-aza-dC可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞中RASSF2A基因甲基化狀態(tài),提高其mRNA的表達(dá),為卵巢癌的臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R737.31
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號(hào)說明
第一部分
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    第一部分相關(guān)圖表
    參考文獻(xiàn)
第二部分
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    第二部分相關(guān)圖表
    參考文獻(xiàn)
第三部分
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    第三部分附圖表
    參考文獻(xiàn)
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本文編號(hào)：2835277