性激素屬于類固醇甾體類激素,主要包括雌激素、雄激素和孕激素,成年女性體內(nèi)性激素的分泌呈現(xiàn)周期性變化。性激素的生成過程包括一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)。在反應(yīng)的第一個酶促步驟中,類膽固醇作為合成類固醇甾體類激素的原料之所以能夠?qū)崿F(xiàn)從線粒體外膜至線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn),主要是受到了類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Steroidogenic acute regulatory,StAR)的作用。這是甾體類激素生成的重要步驟,也是限速步驟。因此StAR被稱為類固醇激素生成的限速酶。在此限速步驟之后,受到膽固醇側(cè)鏈裂解酶(The cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)的作用,進(jìn)入線粒體內(nèi)的膽固醇則會轉(zhuǎn)變?yōu)樵屑に�、雄激素和雌激素等性激素合成的前體物質(zhì)——孕烯醇酮。褪黑素(N-乙酰-5-甲氧色胺,Melatonin)是由松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素,參與很多重要的生理功能,并且能夠調(diào)控與晝夜節(jié)律和生殖相關(guān)的多種中樞和外周活動。植物與動物中均存在褪黑素受體(Melatonin receptor,MT),在哺乳動物中已被克隆的褪黑素膜表面受體為MT1(又稱Mel 1a)和MT2(又稱Mel 1b),均為具有7個跨膜段的G蛋白耦聯(lián)受體。褪黑素通過MT介導(dǎo)cAMP(cyclic adenosine monophosphate)、IP3及cGMP(cyclic guanosine monophosphate)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與相應(yīng)的生理病理過程。生殖系統(tǒng)中褪黑素受體存在于子宮、卵巢和乳腺上皮細(xì)胞、黃素化的顆粒細(xì)胞。褪黑素具有抗氧化和抗凋亡的作用,在人卵泡液中高表達(dá),能夠刺激卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)因子的啟動和胚泡的破裂。此外,它還參與下丘腦-垂體-性腺軸功能和生殖內(nèi)分泌活動的調(diào)節(jié)。大量研究表明褪黑素對生殖系統(tǒng)的作用因物種種類、生理狀態(tài)不同而表現(xiàn)出抑制、促進(jìn)或無作用的多重性。生殖系統(tǒng)中已知的參與調(diào)控StAR表達(dá)的主要信號通路為cAMP-PKA(Cyclic adenosine monophosphate/Protein kinase A)信號通路。除此之外,也有很多其他的激素、生長因子或細(xì)胞因子可以通過激活不同的胞內(nèi)信號通路參與調(diào)控StAR的表達(dá)。其中在顆粒細(xì)胞中LH/hCG(Luteinizing hormone/Human chorionic gonadotrophin)可以調(diào)控StAR的表達(dá)。表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)相關(guān)家族因子及受體在生殖系統(tǒng)廣泛分布,與多種生殖過程相關(guān)。其中體內(nèi)及體外實(shí)驗均已經(jīng)證實(shí),AREG(Amphiregulin)作為LH/hCG峰后卵泡液內(nèi)表達(dá)量最多的EGF家族成員,具有LH樣作用,即促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、促進(jìn)卵丘復(fù)合體(Cumulus oocyte complex,COC)擴(kuò)張、通過調(diào)控環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表達(dá)調(diào)控排卵的發(fā)生。已有的研究也證實(shí)了AREG同樣在StAR的生成過程中起著重要的作用。其中,在人顆粒細(xì)胞中,AREG已被證實(shí)可以通過與表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié)合而活化ERK1/2信號通路上調(diào)StAR的表達(dá)。褪黑素及其受體在LH/hCG峰后也急速上升,且同樣可以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、促進(jìn)排卵。此外,褪黑素已被證實(shí)參與調(diào)控cAMP-PKA信號通路。但其是否影響StAR的表達(dá)以及褪黑素與AREG是否具有協(xié)調(diào)作用來一起參與調(diào)控StAR的表達(dá)尚不十分清楚。因此,本文旨在研究褪黑素是否參與調(diào)控StAR表達(dá)以及是否與AREG具有協(xié)調(diào)作用來一起參與調(diào)控StAR的表達(dá),并進(jìn)一步深入研究其中可能的作用機(jī)制。目的:證實(shí)在人顆粒細(xì)胞中,褪黑素是否參與調(diào)控StAR表達(dá)生成及其調(diào)控機(jī)制以及褪黑素是否與AREG具有協(xié)調(diào)作用可以一起參與調(diào)控StAR的表達(dá)及其中可能的作用機(jī)制。方法:我們以人原代顆粒細(xì)胞為研究模型,探究褪黑素是否參與調(diào)控StAR表達(dá)生成及其中相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。主要通過實(shí)時熒光定量PCR(Real time-qPCR,RT-qPCR)和western blotting技術(shù)對顆粒細(xì)胞中RNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。對卵泡液內(nèi)褪黑素的濃度以及血清內(nèi)孕激素的濃度進(jìn)行了檢測,分別應(yīng)用了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)的檢測方法。結(jié)果:在人顆粒細(xì)胞中,褪黑素可以增強(qiáng)StAR表達(dá),這種的上調(diào)作用具有時間與劑量依賴性且這種上調(diào)作用可被其受體抑制劑Luzindole所阻斷;褪黑素可通過活化PKA/CREB信號通路調(diào)控StAR的表達(dá),且這種調(diào)控作用可被PKA抑制劑H89所阻斷;褪黑素可增強(qiáng)AREG作用下StAR的表達(dá);褪黑素通過與EGFR結(jié)合活化ERK1/2信號通路增強(qiáng)AREG作用下StAR的表達(dá);褪黑素對AREG的這種協(xié)同增強(qiáng)作用可被EGFR抑制劑AG1478所阻斷;此外,卵泡液內(nèi)褪黑素的濃度與hCG日、取卵日(Oocyte pick up,OPU)血清內(nèi)孕激素的濃度存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論:1.在人顆粒細(xì)胞中,褪黑素可通過與其受體MT結(jié)合活化PKA/CREB信號通路直接調(diào)控StAR的表達(dá);2.在人顆粒細(xì)胞中,褪黑素可通過與EGFR結(jié)合活化ERK1/2信號通路協(xié)同增強(qiáng)AREG作用下的StAR表達(dá);3.卵泡液內(nèi)褪黑素的濃度與血清內(nèi)孕激素的濃度呈正相關(guān)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R71
【部分圖文】：

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圖 2：在人顆粒細(xì)胞中，褪黑素通過與 MT 結(jié)合促進(jìn) StAR 蛋白的表達(dá)。分別使用 DMSzindole（10nM）來對顆粒細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，約 1h，再給予褪黑素（0.5mmol/L），于 集顆粒細(xì)胞的蛋白， StAR 的蛋白表達(dá)量的變化檢測主要通過 western blotting 實(shí)驗。實(shí)驗結(jié)果的表示為：獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗（至少三次）的結(jié)果表示“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，不注字母代表著 p<0.05，表示具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。3 在人顆粒細(xì)胞中褪黑素通過 PKA/CREB 信號通路調(diào)控 StAR達(dá)為了檢測 CREB 信號通路是否參與了褪黑素對 StAR 的調(diào)控過程，使mmol/L 的褪黑素分別對顆粒細(xì)胞進(jìn)行 10min、30min、60min 的處理，然后對應(yīng)的蛋白質(zhì)，采用 western blotting 的方法探究褪黑素對 CREB 的磷酸化（pCREB）的影響。Western blotting 的結(jié)果顯示，褪黑素作用 10min 后即著促進(jìn) CREB 的磷酸化（附圖 3A）。此外，使用 PKA 通路特異抑制劑探黑素調(diào)控 StAR 表達(dá)的通路(附圖 3B)。結(jié)果顯示，PKA 通路抑制劑 H89 能褪黑素對 StAR 的調(diào)控作用。因此，褪黑素通過 PKA/CREB 信號通路參與

附圖 3：在人顆粒細(xì)胞中，CREB 信號通路介導(dǎo)褪黑素對 StAR 蛋白的誘導(dǎo)作用。圖 A：使用褪黑素（0.5mmol/L）處理顆粒細(xì)胞，分別作用 10min、30 min、60 min。使用western-blotting 的方法檢測磷酸化 CREB（p-CREB）的蛋白表達(dá)水平。洗脫該膜上的一抗，使用 CREB 再次孵育，檢測 CREB 蛋白的表達(dá)水平。圖 B: 預(yù)處理顆粒細(xì)胞 60min（分別使用 DMSO, H89），再給予 0.5mmol/L 褪黑素刺激顆粒細(xì)胞 24h， StAR 蛋白的表達(dá)水平的差異通過 western-blotting 實(shí)驗來檢測�！� x ±s”來表示 3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗結(jié)果，不同的標(biāo)注字母代表著 p<0.05，表示具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。3.4 人顆粒細(xì)胞中，褪黑素可增強(qiáng) AREG 受體 EGFR 的表達(dá)將人原代顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，從時間及濃度方面探究褪黑素對 EGFR 表達(dá)的作用特點(diǎn)。結(jié)果顯示，0.05mmol/L 及 0.5mmol/L 的褪黑素作用 24h 后均能明顯上調(diào) EGFR 蛋白的表達(dá)，并且當(dāng)褪黑素作用濃度為 0.5mmol/L 時，其對 StAR蛋白的上調(diào)作用更為顯著（附圖 4A）。使用 0.5mmol/L 的褪黑素作用于顆粒細(xì)胞，于不同時間點(diǎn)收集蛋白，結(jié)果顯示當(dāng)褪黑素作用時間為 24h 時，其對 EGFR蛋白的上調(diào)作用更為顯著（附圖 4B）。

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