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前列腺素及其受體在月經(jīng)發(fā)生中對(duì)子宮內(nèi)膜崩解脫落作用機(jī)制的研究

發(fā)布時(shí)間:2020-09-25 19:13
   月經(jīng)是包括人類等高等靈長(zhǎng)類以及少數(shù)其它胎盤動(dòng)物所特有的,子宮內(nèi)膜發(fā)生周期性脫落的生理現(xiàn)象。分析子宮內(nèi)膜發(fā)生周期性崩解剝脫出血,是理解異常出血機(jī)制和尋找治療異常出血策略的關(guān)鍵所在。月經(jīng)周期占據(jù)著婦女生育期的大部分時(shí)間,對(duì)女性生殖健康具有十分重大的意義。經(jīng)典的月經(jīng)發(fā)生假說認(rèn)為月經(jīng)周期分泌晚期,孕酮的撤退致使多種前列腺素PGs(Prostagladins)的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜螺旋動(dòng)脈的收縮而造成子宮內(nèi)膜崩解出血。PGs在月經(jīng)發(fā)生中的主導(dǎo)作用是這一假說成立與否的關(guān)鍵。雖然早在1957年,Pickles首次在經(jīng)血中也檢測(cè)到了PGs的存在,然而PGs在月經(jīng)發(fā)生中的主導(dǎo)作用存在爭(zhēng)議。有研究報(bào)道顯示PGs與靈長(zhǎng)類特有的月經(jīng)發(fā)生具有始動(dòng)作用。主要包括以下幾點(diǎn):1)在人的經(jīng)血中,檢測(cè)到了脂溶性的血管活性物質(zhì),最終認(rèn)為前列腺素E2(ProstagladinsE2,PGE2)和前列腺素 2α(ProstagladinsF2α,PGF2α);2)PGE2和 PGF2α在子宮內(nèi)膜中存在,且在分泌晚期和月經(jīng)期中顯著增加;3)在人的子宮腔內(nèi),注射PGF2α可以導(dǎo)致子宮的收縮;4)PGs的限速合成酶環(huán)氧合酶(COX),其抑制劑NSAIDs能夠減少月經(jīng)過多婦女的出血。有些觀點(diǎn)確認(rèn)為PGs對(duì)月經(jīng)發(fā)生不具有始動(dòng)作用[1]。本研究以在小鼠月經(jīng)樣模型和永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞,這兩個(gè)水平上,探討了孕酮撤退后PGs和PGs受體在月經(jīng)發(fā)生過程中的調(diào)控關(guān)系。建立小鼠月經(jīng)樣模型,P4撤退的0~24h,探討PGs和PGs受體在崩解期的表達(dá)和作用。發(fā)現(xiàn)PGE2和PGF2α均有所增加,而且PGF2α受體PTGFR(Prostaglandin F Receptor)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加,提示PTGFR與月經(jīng)期子宮內(nèi)膜的崩解和脫落有關(guān)系;分別用PTGFR和PTGER2(Prostaglandin E Receptor 2)抑制劑分別抑制其受體的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期P4撤退24h,PGF2α/PTGFR對(duì)子宮內(nèi)膜崩解剝脫更為重要,進(jìn)一步,本研究發(fā)現(xiàn),PTGFR能夠通過血管生成抑制素(angiostatin)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的崩解脫落;HIF1α作為調(diào)控子宮內(nèi)膜崩解的主要分子,在子宮內(nèi)膜崩解時(shí)與PTGFR具有時(shí)空表達(dá)一致性。在小鼠月經(jīng)樣模型和細(xì)胞系中通過HIF1α抑制劑2ME抑制HIF1α的入核,抑制其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能,結(jié)合本研究小組既往以及現(xiàn)有工作,HIF1α和PTGFR對(duì)子宮內(nèi)膜崩解脫落起重要作用,發(fā)現(xiàn)HIF1α能夠調(diào)控PTGFR導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的崩解脫落;首次在永生化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞中,成功模擬月經(jīng)子宮內(nèi)膜的蛻膜化及P4撤退模型,并在細(xì)胞模型中驗(yàn)證二者關(guān)系;進(jìn)一步,采用ChIP方法在小鼠月經(jīng)樣模型中初步驗(yàn)證二者之間直接結(jié)合的可能性。本研究得到的結(jié)果如下:1.在小鼠月經(jīng)樣模型的子宮組織中,PGE2的含量在子宮內(nèi)膜崩解脫落期增加,特別是子宮內(nèi)膜崩解期P4撤退12~16 h顯著增加,提示PGE2對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解起重要作用。PGF2α在月經(jīng)期P4撤退8h顯著增加,在P4撤退后16h達(dá)到最大值。這與子宮內(nèi)膜在發(fā)生崩解壞死的關(guān)鍵期相符,其含量的變化與子宮內(nèi)膜崩解的進(jìn)程緊密相關(guān),提示PGF2α對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解最為重要。在子宮內(nèi)膜的崩解脫落期,特別是在P4撤退后12~16h,PTGFRmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加,提示PTGFR與月經(jīng)期子宮內(nèi)膜的崩解剝脫有關(guān)。2.在小鼠月經(jīng)樣模型中P4撤退后24 h,PTGFR和PTGER2受體抑制劑能明顯的抑制子宮內(nèi)膜的崩解脫落,PTGFR抑制劑的抑制效果比PTGER2更明顯。因此,在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期,PTGFR對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解作用更為重要。同時(shí)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中首次利用永生化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞,建立體外月經(jīng)樣變化的細(xì)胞模型,體外誘導(dǎo)蛻膜化。發(fā)現(xiàn),Ptgfr基因在P4撤退后16 h表達(dá)最高,在P4撤退后24 h略有下降。在人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證了二者的調(diào)控關(guān)系。3.在小鼠月經(jīng)樣模型中,PTGFR抑制劑在P4撤退后8~24 h通過上調(diào)其下游血管抑制素蛋白質(zhì)的表達(dá),抑制血管通透性參與抑制子宮內(nèi)膜崩解;NF-κB p65 mRNA在8~24 h表達(dá)降低,因此PTGFR抑制劑可能通過抑制NF-κB p65 mRNA的表達(dá),參與抑制子宮內(nèi)膜崩解,但不通過血管內(nèi)膜生長(zhǎng)因子VEGF調(diào)控這一過程。4.在小鼠月經(jīng)樣模型中,HIF1α在子宮內(nèi)膜崩解時(shí)與PTGFR具有時(shí)空表達(dá)一致性,結(jié)合本研究小組既往以及現(xiàn)有工作,HIF1α和PTGFR對(duì)子宮內(nèi)膜崩解脫落起重要作用,發(fā)現(xiàn)HIF1α能夠調(diào)控PTGFR導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的崩解脫落。結(jié)論:1.在小鼠樣月經(jīng)樣模型中PGF2α及其受體PTGFR,PGE2及其受體PTGER2表達(dá)均升高,而且PTGFR受體在子宮內(nèi)膜崩解剝脫的過程中起更重要的作用。2.抑制劑處理后,PTGFR對(duì)子宮內(nèi)膜崩解剝脫的作用,可能通過血管生成抑制素途徑,降低血管通透性;可能通過抑制NF-KBp65mRNA的炎癥信號(hào)通路,抑制調(diào)控子宮內(nèi)膜的崩解剝脫過程。3.PTGFR可能通過上游HIF1α的調(diào)控調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜崩解剝脫,而且HIF1α與PTGFR可能有直接結(jié)合的關(guān)系。
【學(xué)位單位】:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類】:R711
【部分圖文】:

曲線,樣模,月經(jīng),小鼠


on-peccnng、,oacvy、逡逑BO邋(MaximumBinding)、標(biāo)準(zhǔn)品(Standards)和樣品孔;逡逑(3)每個(gè)孔根據(jù)不同試劑盒的要求加入相應(yīng)的試劑,NSB、Blk、B0和Sample/std逡逑分解加入邋Elisa邋Buffer。B0邋和邋Sample/std邋加入邋Primary邋Antibody邋solution邋后,逡逑室溫孵育1邋h,后直接加入Conjunction邋solution,室溫孵育2邋h,同時(shí)配置逡逑Washing邋Buffer和Substation邋Solution。洗板4次,每次洗板后在紙巾上輕拍。逡逑加入Substation邋Solution室溫避光孵育;逡逑(4)最后一步顯色完成后30邋min內(nèi),根據(jù)試劑盒所需的波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的OD逡逑值;逡逑(5)根據(jù)每個(gè)試劑盒的不同要求擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)公式計(jì)算得到組織均漿中每逡逑毫克組織標(biāo)本中含有前列腺素的量;逡逑(6)邐3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的相對(duì)表達(dá)量,用平均值±SEM值作圖表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分逡逑析用t檢驗(yàn)(Student’s邋t-test)或單因素方差分析(one-way邋analysis)檢驗(yàn)其逡逑差異性。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用秩和檢驗(yàn)(ranksumtest)。當(dāng)戶<0.05視為差異逡逑顯著,戶<0.01差異極顯著;逡逑(7)每個(gè)前列腺素檢測(cè)的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1-2):逡逑A邋120邐X—,邐........—...........邋8邋100逡逑

熔解曲線,曲線圖,非正態(tài)分布,秩和檢驗(yàn)


4)數(shù)據(jù)分析(AACt法)逡逑利用Step-One?實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀后,得到各個(gè)樣品所擴(kuò)增基因的Ct逡逑值,擴(kuò)增曲線和熔解曲線(見圖1-3)。逡逑A邐Melt邋Curve邐B邐Amplification邋Plot逡逑100邋?逡逑-一逡逑-邐I邋'逡逑i=邋r;邋Ajf逡逑—邐j邋;邐ow,邐/邋/-y逡逑…。邐h丨丨邐_邋f逡逑I邋I逡逑二一邋,/邐0邋00001逡逑iooooo逡逑,逡逑、邋0000001邋-邋邐邋—-—邋-邋-逡逑^邐X.邐邋2邐?邐?邐?邋Nnu?i<?sa?aai>xiMaBa逡逑mo邐roo邐rso邐^邋■0邋o邐mb邐■00邐mo邐Cytld逡逑■二滝B邋灥C?BD邋畫邋EHIF邐■*邋1邋B邋?C邋■0逡逑|邐_E邋_P邐逡逑圖1-3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖(A),實(shí)時(shí)PCR熔解曲線(B)。逡逑根據(jù)擴(kuò)增曲線得到目的基因的Ct值,代入公式:逡逑/\Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因逡逑AACt=ACt實(shí)驗(yàn)組-ACt實(shí)驗(yàn)對(duì)照組逡逑實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為實(shí)驗(yàn)處理的對(duì)照組,如孕酮撤退前的Oh。逡逑mRNA邋Relative邋expression邋=邋2 ̄AACt逡逑三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的某個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量,用平均值±SEM值作圖表示。數(shù)逡逑據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用t檢驗(yàn)(Student’s邋t-test)或單因素方差分析(one-way邋analysis)檢驗(yàn)逡逑其差異性。經(jīng)檢驗(yàn)非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用秩和檢驗(yàn)(rank邋sum邋test)。當(dāng)P<0.05視為差異逡逑顯者

樣模,臺(tái)盼藍(lán)染色,蛋白,月經(jīng)


京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院邐博士研究生學(xué)位論文逡逑b.細(xì)胞核蛋白提取逡逑將提取過細(xì)胞質(zhì)蛋白的沉淀,加入500邋mL預(yù)冷的1XPBS,邋12000邋g離心2邋min。逡逑輕吸走液體,棄上清。每個(gè)樣本加入300邋|iL預(yù)冷的細(xì)胞核提取液,置于振蕩器上逡逑分震蕩15邋sec,后冰上放置2邋min。重復(fù)4次。后在冰上靜止10邋min。分別取2邋pL的逡逑胞質(zhì)蛋白液體和2邋pL邋2%臺(tái)盼藍(lán)染液,充分混勻,靜止2邋min后。滴在載玻片上,逡逑并蓋上24X24邋mm的蓋玻片,在20邋X普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢。觀察細(xì)胞核膜是否破逡逑,細(xì)胞核蛋白完全釋放出來。12000邋g離心6邋min,輕輕吸出上清即為細(xì)胞核蛋白逡逑(見圖1-4)。離心后的上清液迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的新離心管中,液氮速凍,-80°C冰逡逑保存。逡逑^胞質(zhì)蛋白邐邐胞核蛋白逡逑

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3 袁絲絲;護(hù)卵湯對(duì)薄型子宮內(nèi)膜模型大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路影響的研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2018年

4 張坪;坤靈丸對(duì)反復(fù)移植失敗患者著床期子宮內(nèi)膜內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)及血管形成的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

5 雷敏;子宮內(nèi)膜微刺激術(shù)在凍融胚胎移植周期中的應(yīng)用研究[D];南華大學(xué);2018年

6 林家琪;孕酮對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

7 何東云;補(bǔ)腎調(diào)沖湯治療薄型子宮內(nèi)膜的臨床研究[D];廣西中醫(yī)藥大學(xué);2018年

8 廖貴鳳;益宮養(yǎng)胞湯治療腎氣虛證子宮內(nèi)膜薄型不孕癥的臨床觀察[D];廣西中醫(yī)藥大學(xué);2018年

9 胡艷紅;護(hù)卵湯對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠內(nèi)膜細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2018年

10 韓國(guó)慶;AMHR2在圍種植期大鼠子宮內(nèi)膜表達(dá)模式的探討[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2018年



本文編號(hào):2826952

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