第一部分基于近親婚配家系識別復發(fā)性流產(chǎn)的致病基因及突變目的:本研究旨在利用全外顯子組測序(WES)技術識別1個復發(fā)性流產(chǎn)(RPL)近親婚配家系的致病基因及突變,為了解RPL的病理機制提供新的線索和依據(jù)。材料與方法:本研究收集到1個珍貴的RPL近親婚配家系,患者父母為表兄妹關系,無自然流產(chǎn)史,子代中3位女性均診斷為非綜合征型RPL,遺傳因素可能是導致該家系RPL發(fā)生的原因。選擇該家系中的3名患者在Illunima的HiSeq 2500平臺進行全外顯子組測序。對獲得的全部WES數(shù)據(jù)進行過濾,保留3名患者共享的罕見純合非同義變異。然后,通過進一步綜合篩選和分析,鑒定出該RPL近親婚配家系的最優(yōu)候選致病基因及突變并在家系成員中進行基因型-疾病表型共分離分析。在另外264例無血緣關系RPL患者中,對候選基因編碼區(qū)及兩側剪切位點進行Sanger測序,篩查罕見變異。結果:系譜分析表明該RPL家系存在隱性遺傳模式。對全部WES數(shù)據(jù)進行過濾后,共有6個3名患者共享的罕見純合變異被保留。對這些基因及變異進行綜合分析排序,CAPS(NM_004058.5:c.377delC,p.Leu127Trpfs)純合無義突變可能是該 RPL 家系的致病基因及突變。Sanger測序確定3名患者均攜帶該位點的純合變異,而他們的父母為雜合子攜帶者。該變異位點極為罕見并在物種間高度保守。我們在3名無血緣關系RPL患者中發(fā)現(xiàn)另外3個罕見的雜合變異但沒能發(fā)現(xiàn)罕見純合或復合雜合變異。結論:我們的研究結果表明,常染色體純合無義突變CAPS p.Leu127Trpfs,可能是導致RPL發(fā)生的母體致病基因及突變。第二部分復發(fā)性流產(chǎn)中鈣磷蛋白的生物學作用研究目的:本研究旨在初步探索復發(fā)性流產(chǎn)中鈣磷蛋白(CAPS)的生物學作用。材料與方法:免疫熒光組織化學檢測孕早期自愿終止妊娠患者流產(chǎn)蛻膜和絨毛組織中CAPS的表達和分布。熒光定量PCR(qPCR)檢測CAPS在無血緣關系RPL患者和對照組蛻膜和胎盤絨毛組織中的表達。對于人子宮內膜上皮細胞RL95-2:qPCR和Western blot驗證有效的CAPS特異性干擾RNA;qPCR檢測分泌型磷蛋白1(SPP1)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達;ELISA檢測培養(yǎng)上清中前列腺素E2(PGE2)的含量;Fluo-3,AM結合流式細胞術檢測細胞內鈣離子濃度。對于人胎盤絨毛膜癌細胞JAR:Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力;流式細胞術檢測細胞凋亡水平。分離培養(yǎng)及免疫熒光鑒定人早孕期蛻膜腺上皮細胞,利用雙重免疫熒光結合激光共聚焦顯微鏡檢測CAPS的亞細胞定位,是否能夠與內質網(wǎng)標記物PDIA3共定位。結果:人早孕期蛻膜組織中CAPS僅表達于蛻膜腺上皮細胞;在絨毛組織中,CAPS僅表達于合體滋養(yǎng)細胞。與對照組相比,RPL患者的蛻膜和胎盤絨毛組織中CAPS表達下調。敲低CAPS表達可能促進子宮內膜容受性相關分子SPP1和MMP9的表達以及PGE2的釋放,同時可以降低細胞內鈣離子濃度。敲低CAPS表達,JAR細胞遷移和侵襲略有下降,對細胞凋亡無影響。人早孕期流產(chǎn)的原代蛻膜腺上皮細胞中CAPS能夠與PDIA3共定位,提示CAPS在內質網(wǎng)有分布。結論:CAPS在人早孕期蛻膜腺上皮細胞中特異性高表達,在內質網(wǎng)中有分布,其低表達可能通過降低蛻膜腺上皮細胞中鈣離子濃度使子宮內膜容受性相關因子過度表達進而導致RPL發(fā)生。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R714.21
【部分圖文】：

早期流產(chǎn)最常見的原因，在自然選擇機制作用下，高達９０％的染色體異常胚胎會自逡逑發(fā)流產(chǎn)。然而，在ＲＰＬ病例中，具有正常核型的流產(chǎn)胎兒的比例隨著流產(chǎn)總數(shù)的累逡逑積幾乎呈線性增加［１１，１２］，提示有其他致病因素的存在。如圖１－１所示，目前對導致逡逑ＲＰＬ的病因的共識是：宮腔內妊娠組織（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ，邋ＰＯＣ）的染色體異逡逑常（約３０－５０％）；夫妻任何一方的染色體異常（約１０％）；女性解剖異常，如子宮逡逑畸形、纖維瘤和子宮內膜息肉（約１０％－２０％）；女性內分泌紊亂，如亞臨床的低或逡逑高滲、高催乳素血癥和月經(jīng)紊亂（約１０％－２０％）；夫妻任何一方免疫因素，如女性逡逑伴侶的抗a愔酆險鰨ǎ粒睿簦椋穡瑁錚螅穡瑁錚歟椋穡椋溴澹螅睿洌潁錚恚�，邋ＡＰ雪（约邋１０％－２０％）－h(huán)蚱奕五義蝦我環(huán)繳車欄腥荊ㄔ跡埃擔ィ擔ィ╁澹郟保常蕁４送�，虽然脫]星坑辛Φ鬧ぞ荼礱饜睦硨突峰義暇騁蛩氐淖饔茫且部贍芑嵊輾ⅲ遙校痰姆⑸歡�，由幼曊E煌難芯恐行膩義嫌τ昧瞬煌惱鋃媳曜祭炊ㄒ澹遙校譚蚋

本文編號：2826144