第一部分基于近親婚配家系識別復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的致病基因及突變目的:本研究旨在利用全外顯子組測序(WES)技術(shù)識別1個復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)近親婚配家系的致病基因及突變,為了解RPL的病理機(jī)制提供新的線索和依據(jù)。材料與方法:本研究收集到1個珍貴的RPL近親婚配家系,患者父母為表兄妹關(guān)系,無自然流產(chǎn)史,子代中3位女性均診斷為非綜合征型RPL,遺傳因素可能是導(dǎo)致該家系RPL發(fā)生的原因。選擇該家系中的3名患者在Illunima的HiSeq 2500平臺進(jìn)行全外顯子組測序。對獲得的全部WES數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾,保留3名患者共享的罕見純合非同義變異。然后,通過進(jìn)一步綜合篩選和分析,鑒定出該RPL近親婚配家系的最優(yōu)候選致病基因及突變并在家系成員中進(jìn)行基因型-疾病表型共分離分析。在另外264例無血緣關(guān)系RPL患者中,對候選基因編碼區(qū)及兩側(cè)剪切位點進(jìn)行Sanger測序,篩查罕見變異。結(jié)果:系譜分析表明該RPL家系存在隱性遺傳模式。對全部WES數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后,共有6個3名患者共享的罕見純合變異被保留。對這些基因及變異進(jìn)行綜合分析排序,CAPS(NM_004058.5:c.377delC,p.Leu127Trpfs)純合無義突變可能是該 RPL 家系的致病基因及突變。Sanger測序確定3名患者均攜帶該位點的純合變異,而他們的父母為雜合子攜帶者。該變異位點極為罕見并在物種間高度保守。我們在3名無血緣關(guān)系RPL患者中發(fā)現(xiàn)另外3個罕見的雜合變異但沒能發(fā)現(xiàn)罕見純合或復(fù)合雜合變異。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,常染色體純合無義突變CAPS p.Leu127Trpfs,可能是導(dǎo)致RPL發(fā)生的母體致病基因及突變。第二部分復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中鈣磷蛋白的生物學(xué)作用研究目的:本研究旨在初步探索復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中鈣磷蛋白(CAPS)的生物學(xué)作用。材料與方法:免疫熒光組織化學(xué)檢測孕早期自愿終止妊娠患者流產(chǎn)蛻膜和絨毛組織中CAPS的表達(dá)和分布。熒光定量PCR(qPCR)檢測CAPS在無血緣關(guān)系RPL患者和對照組蛻膜和胎盤絨毛組織中的表達(dá)。對于人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞RL95-2:qPCR和Western blot驗證有效的CAPS特異性干擾RNA;qPCR檢測分泌型磷蛋白1(SPP1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá);ELISA檢測培養(yǎng)上清中前列腺素E2(PGE2)的含量;Fluo-3,AM結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。對于人胎盤絨毛膜癌細(xì)胞JAR:Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平。分離培養(yǎng)及免疫熒光鑒定人早孕期蛻膜腺上皮細(xì)胞,利用雙重免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測CAPS的亞細(xì)胞定位,是否能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物PDIA3共定位。結(jié)果:人早孕期蛻膜組織中CAPS僅表達(dá)于蛻膜腺上皮細(xì)胞;在絨毛組織中,CAPS僅表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞。與對照組相比,RPL患者的蛻膜和胎盤絨毛組織中CAPS表達(dá)下調(diào)。敲低CAPS表達(dá)可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)分子SPP1和MMP9的表達(dá)以及PGE2的釋放,同時可以降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。敲低CAPS表達(dá),JAR細(xì)胞遷移和侵襲略有下降,對細(xì)胞凋亡無影響。人早孕期流產(chǎn)的原代蛻膜腺上皮細(xì)胞中CAPS能夠與PDIA3共定位,提示CAPS在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有分布。結(jié)論:CAPS在人早孕期蛻膜腺上皮細(xì)胞中特異性高表達(dá),在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有分布,其低表達(dá)可能通過降低蛻膜腺上皮細(xì)胞中鈣離子濃度使子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子過度表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致RPL發(fā)生。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714.21
【部分圖文】：

早期流產(chǎn)最常見的原因，在自然選擇機(jī)制作用下，高達(dá)９０％的染色體異常胚胎會自逡逑發(fā)流產(chǎn)。然而，在ＲＰＬ病例中，具有正常核型的流產(chǎn)胎兒的比例隨著流產(chǎn)總數(shù)的累逡逑積幾乎呈線性增加［１１，１２］，提示有其他致病因素的存在。如圖１－１所示，目前對導(dǎo)致逡逑ＲＰＬ的病因的共識是：宮腔內(nèi)妊娠組織（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ，邋ＰＯＣ）的染色體異逡逑常（約３０－５０％）；夫妻任何一方的染色體異常（約１０％）；女性解剖異常，如子宮逡逑畸形、纖維瘤和子宮內(nèi)膜息肉（約１０％－２０％）；女性內(nèi)分泌紊亂，如亞臨床的低或逡逑高滲、高催乳素血癥和月經(jīng)紊亂（約１０％－２０％）；夫妻任何一方免疫因素，如女性逡逑伴侶的抗a愔酆險鰨ǎ粒睿簦椋穡瑁錚螅穡瑁錚歟椋穡椋溴澹螅睿洌潁錚恚�，邋ＡＰ雪（约邋１０％－２０％）－h(huán)蚱奕五義蝦我環(huán)繳車欄腥荊ㄔ跡埃擔(dān)ィ擔(dān)ィ╁澹郟保常蕁４送�，虽然脫]星坑辛Φ鬧ぞ荼礱饜睦硨突峰義暇騁蛩氐淖饔�，但它们也抠犥会虞殺＿b校痰姆⑸歡�，由幼曊E煌難芯恐行膩義嫌τ昧瞬煌惱鋃媳曜祭炊ㄒ澹遙校譚蚋

本文編號：2826144