目的子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity,ER)是指子宮內(nèi)膜處于一種允許囊胚定位、黏附、侵入并使內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生改變從而導(dǎo)致胚胎著床的狀態(tài)。這個(gè)過(guò)程需要多種精密而復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology,ART)不斷進(jìn)步和完善使得臨床妊娠率有了較大的提高,但是子宮內(nèi)膜容受性降低仍舊是阻礙胚胎著床,影響妊娠率的重要原因。子宮內(nèi)膜容受性的影響因素有許多,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在許多物種的早期妊娠中起關(guān)鍵作用,并且VEGF水平的改變會(huì)嚴(yán)重影響囊胚植入率。研究VEGF在子宮內(nèi)膜中的調(diào)控作用有助于發(fā)現(xiàn)其潛在分子標(biāo)志物和有效的改善方法。本文檢測(cè)了反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中miR-140-5p和VEGF的表達(dá)水平,并構(gòu)建人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株,通過(guò)研究對(duì)孕酮/miR-140-5p/VEGF的表達(dá)水平檢測(cè)和細(xì)胞功能學(xué)分析,明確了該信號(hào)軸對(duì)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的功能學(xué)效應(yīng),揭示了miR-140-5p作為子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子在提高妊娠率上的潛在應(yīng)用價(jià)值,為改善子宮內(nèi)膜容受性提供了潛在靶點(diǎn)。方法1.VEGF在反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其對(duì)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響收集20例經(jīng)體外受精-胚胎移植反復(fù)種植失敗患者和20例自然周期復(fù)蘇移植成功妊娠患者的子宮內(nèi)膜組織樣本,采用western blotting及qRT-PCR方法檢測(cè)VEGF的表達(dá)水平。通過(guò)CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF異常表達(dá)對(duì)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometrial epithelial cell,EEC)功能的影響。采用western blotting方法檢測(cè)人反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜及VEGF異常表達(dá)的EEC中LIF的表達(dá)水平。采用qRT-PCR、western blotting方法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)VEGF異常表達(dá)時(shí),細(xì)胞周期相關(guān)因子CCNB1、CCND1、和CDK2的水平變化和對(duì)細(xì)胞周期的影響。2.miR-140-5p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)影響人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖我們通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可以靶向調(diào)控VEGF的miRNAs,重點(diǎn)關(guān)注miR-140-5p,采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證了miR-140-5p和VEGF之間的靶向關(guān)系。采用qRT-PCR檢測(cè)20例經(jīng)體外受精-胚胎移植反復(fù)種植失敗患者和20例自然周期復(fù)蘇移植成功妊娠患者的子宮內(nèi)膜組織中miR-140-5p的表達(dá)水平。采用qRT-PCR和western blotting方法檢測(cè)了miR-140-5p異常表達(dá)對(duì)VEGF表達(dá)的影響。采用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-140-5p異常表達(dá)對(duì)EEC活性的影響。3.孕酮對(duì)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響采用不同濃度(0、1、5和10 nmol/L)的孕酮處理EEC,再采用10nmol/L孕酮處理EEC12、24和36小時(shí),通過(guò)CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EEC的活性。并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)孕酮10 nmol/L處理EEC24小時(shí)后,miR-140-5p和VEGF mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果1.VEGF在反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及其對(duì)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF表達(dá)顯著性降低(P0.001)。VEGF可促進(jìn)了EEC的增殖,而抑制VEGF的表達(dá)則抑制EEC的生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比,反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中的LIF蛋白表達(dá)水平降低。VEGF過(guò)表達(dá)時(shí)EEC中LIF蛋白水平增高,而VEGF抑制表達(dá)時(shí),LIF蛋白表達(dá)水平降低。VEGF過(guò)表達(dá)顯著地促進(jìn)了細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子CCNB1、CCND1、和CDK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P0.01或P0.05),而VEGF抑制則降低了這三種調(diào)控因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P0.05)。2.miR-140-5p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)影響人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖在反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者子宮內(nèi)膜組織中,miR-140-5p表達(dá)上調(diào)。VEGF是miR-140-5p的靶基因。過(guò)表達(dá)miR-140-5p可以抑制野生型VEGF3'-UTR的熒光素酶活性,而對(duì)突變型VEGF 3'-UTR偶聯(lián)的熒光素酶活性無(wú)顯著抑制效果。在EEC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-140-5p能顯著抑制細(xì)胞的增殖;而抑制miR-140-5p表達(dá)則顯著性的促進(jìn)了細(xì)胞的增殖(P0.05)。同時(shí),過(guò)表達(dá)miR-140-5p也顯著地抑制了VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P0.05),而miR-140-5p和VEGF mRNA同時(shí)過(guò)表達(dá)則結(jié)果出現(xiàn)了反轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示,miR-140-5p誘導(dǎo)的VEGF mRNA表達(dá)顯示了上調(diào)同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的活性(P0.01)。3.孕酮對(duì)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響孕酮顯著地促進(jìn)了EEC的活性,呈劑量及時(shí)間依賴性(P0.05,P0.01或P0.001)。孕酮處理的EEC克隆形成明顯增多(P0.01)。孕酮顯著地抑制了EEC中miR-140-5p的表達(dá),促進(jìn)了VEGF mRNA的表達(dá)(P0.05,P0.01)。結(jié)論1.VEGF在反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者的子宮內(nèi)膜組織中低表達(dá)。VEGF可促進(jìn)EEC的增殖和細(xì)胞周期。反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜組織和EEC中LIF的表達(dá)水平與VEGF具有一致性。2.miR-140-5p在反復(fù)體外受精-胚胎移植失敗患者的子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá),VEGF是miR-140-5p靶基因,miR-140-5p可通過(guò)靶向VEGF抑制EEC的增殖。3.孕酮可顯著抑制miR-140-5p,促進(jìn)VEGF的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)EEC的增殖。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714.8
【部分圖文】：

1.4.2 反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中 VEGF 異常表達(dá)采用 qRT-PCR 和 western blotting 檢測(cè)對(duì)照組和反復(fù)種植失敗患者組子宮內(nèi)膜組織中 VEGF 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與能夠獲得妊娠的正常子宮內(nèi)膜組織相比，反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜組織中 VEGF 蛋白量顯著性降低（P < 0.001，圖 1.1 A，僅展示四對(duì)典型圖，n=3），同時(shí)，qRT-PCR 結(jié)果表明，在反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜組織中，VEGF mRNA 表達(dá)水平也下調(diào)（圖 1.1 B）。以上結(jié)果表明，反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中 VEGF 異常低表達(dá)（P < 0.001）。

22 VEGF 過(guò)表達(dá)促進(jìn) EEC 的增殖，敲低 VEGF 抑制 EEC 的增殖。（A）采用 qRT-n blotting 檢測(cè) pcDNA3.1-VEGF 和 si-VEGF 的轉(zhuǎn)染效率。（B）CCK-8 法檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞的增殖能力。（C）克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè) VEGF 對(duì) EEC 克隆形成能力的 1.2 Overexpression of VEGF promotes the proliferation of EEC. Knockdown os the proliferation of EEC (A) The transfection efficiency of pcDNA3.1-VEF were examined by qRT-PCR and Western blotting . (B) The cell proliferation abred in 96 h after transfection. (C) Overexpression of VEGF imporved the cloningdown of VEGF inhibited the cloning of EEC.

.4 反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜及 EEC 中 LIF 的異常表達(dá)LIF 的表達(dá)水平可用于評(píng)估不同年齡女性的子宮內(nèi)膜功能[55]。因此，用 VEGF 異常表達(dá)時(shí)對(duì)子宮內(nèi)膜容中 LIF 表達(dá)水平的影響，評(píng)估子宮內(nèi)膜。我們采用了 Western blotting 方法檢測(cè)反復(fù)種植患者的子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞相比，反復(fù)種植患者膜組織中 LIF 蛋白表達(dá)減低（P < 0.01，圖 1.3 A n = 3）。進(jìn)一步DNA3.1-VEGF（VEGF 過(guò)表達(dá)）、si-VEGF（VEGF 低表達(dá)）以及其相應(yīng)對(duì)照轉(zhuǎn)染的 EEC 中，Western blotting 檢測(cè) LIF 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，si-V染的細(xì)胞中，LIF 蛋白表達(dá)降低；相反，pcDNA3.1-VEGF 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，白表達(dá)升高（P < 0.01，圖 1.3 B，n = 3）�？偟膩�(lái)說(shuō)，VEGF 的表達(dá)水F 的表達(dá)水平具有一致性。

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