目的:宮頸癌是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一,由于受到非特異性細胞毒性和耐藥性影響,化療應用受到限制。天然產(chǎn)物百里醌(Thymoquinone,TQ),在不同的癌癥中,可作用于不同的信號傳導途徑,被認為是一種很有前途的抗癌分子。抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)是一種重要的抗癌研究方向。在本研究中,百里醌被用于治療宮頸癌細胞系CaSki和SiHa,從誘導細胞凋亡和抑制侵襲轉(zhuǎn)移方面研究抗腫瘤藥物百里醌對宮頸癌細胞的效應,觀察不同濃度下百里醌對宮頸癌細胞生長的影響,研究對EMT調(diào)控蛋白和癌癥轉(zhuǎn)移的影響。研究百里醌用于治療宮頸癌的機制和可能性,為宮頸癌的臨床治療提供新靶標、新思路。方法:(1)對宮頸癌細胞系CaSki和SiHa,用不同劑量(終濃度0μM/mL、1μM/mL、5μM/mL、10μM/mL、20μM/mL、40μM/mL)的百里醌,作用不同時間(12h、36h、24h和48h)后,應用CCK-8法檢測百里醌對細胞的毒性作用。(2)用實時細胞分析儀檢測百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用下,對宮頸癌細胞系CaSki和SiHa的生長、侵襲、遷移的影響。(3)流式細胞儀檢測百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細胞系CaSki和SiHa后,對細胞凋亡率的影響。(4)實時熒光定量PCR檢測百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細胞系CaSki和SiHa后,EMT分子以及凋亡相關不同基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。(5)Western Blot檢測百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細胞系CaSki和SiHa后,不同EMT分子以及凋亡相關蛋白表達。(6)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、1μM/mL、2μM/mL、4μM/mL、8μM/mL、16μM/mL)作用宮頸癌細胞系CaSki和SiHa后,用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測TQ是否作用于Twist1和Zeb1基因的啟動子。(7)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL)作用于宮頸癌細胞系CaSki和SiHa后,檢測TQ對Twist1的啟動子是否有甲基化作用。結果:(1)通過CCK-8檢測,結果顯示TQ劑量在5μM/mL或者較大劑量,作用時間在24h或者更長,對宮頸癌細胞系CaSki和SiHa有明顯的細胞毒性作用,并呈劑量依賴性。(2)通過實時細胞功能分析儀檢測,百里醌在5μM/mL或更大的劑量下可抑制宮頸癌細胞系CaSki和SiHa的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。(3)流式細胞儀結果表明TQ可以增加宮頸癌細胞系CaSki和SiHa的細胞凋亡率。(4)實時熒光定量PCR檢測,TQ不同劑量(終濃度5μM/mL和10μM/mL)作用24h后,宮頸癌細胞系CaSki和SiHa中Twist1,Zeb1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低,并且E-Cadherin的表達升高。在CaSki細胞系中,還影響了Vimentin和MMP-9,在SiHa細胞系還影響了Slug。Bax和Bcl-2在宮頸癌細胞系CaSki和SiHa中都沒有明顯變化。(5)Western blot結果顯示,TQ不同劑量(終濃度5μM/mL和10μM/mL)作用36h后,宮頸癌細胞系CaSki和SiHa中Twist1,Zeb1的蛋白水平降低,而E-Cadherin的表達水平升高。但宮頸癌細胞系CaSki和SiHa中凋亡相關蛋白PARP,Caspase-3,Caspase-9的蛋白水平幾乎沒有變化。(6)熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治霰砻靼倮秕謩e減少了Twist1和Zeb1的啟動子活性,并且RLU的減少與TQ劑量的增加存在依賴性,證明Twist1和Zeb1可能是百里醌的直接作用靶點。(7)通過百里醌處理(終濃度5μM/mL,24h)后的宮頸癌細胞系CaSki和SiHa,Twist1基因近端啟動子進行甲基化后焦磷酸測序,數(shù)據(jù)分析有輕微增加。結論:我們的研究結果表明,百里醌除了明顯抑制了宮頸癌細胞的增殖,還抑制了癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。百里醌靶向作用于EMT-TFs,如Twist1和Zeb1,是抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移的可能機制。百里醌增加宮頸癌細胞的細胞凋亡率,但機制尚不明確。因此,百里醌可能是一種潛在的治療宮頸癌的化療藥物,但對于百里醌發(fā)展和成為一種臨床藥物,仍需要進一步的基礎和臨床研究。
【學位單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

1 CCK-8檢測百里醌對宮頸癌細胞系CaSki和SiHa的細胞毒性作用。我們使用CCK-8來進行細胞毒性分析，表明百里醌對宮頸癌細胞CaSki和SiHa細胞的細胞毒性具有劑量依賴性(如表2 A&B，圖2A&B)。在CaSki細胞中，經(jīng)過12小時的百里醌處理后，它顯示了劑量依賴效應，在24小時，36小時和48小時之后同樣如此，各用藥組與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(如表2A,圖2A)。然而在SiHa細胞中，百里醌處理12小時后，沒有明顯的影響，但是進行了24小時

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