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百里醌通過(guò)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Twist1和Zeb1抑制宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的侵襲轉(zhuǎn)移

發(fā)布時(shí)間:2020-09-19 18:47
   目的:宮頸癌是世界上最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,由于受到非特異性細(xì)胞毒性和耐藥性影響,化療應(yīng)用受到限制。天然產(chǎn)物百里醌(Thymoquinone,TQ),在不同的癌癥中,可作用于不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,被認(rèn)為是一種很有前途的抗癌分子。抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)是一種重要的抗癌研究方向。在本研究中,百里醌被用于治療宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa,從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制侵襲轉(zhuǎn)移方面研究抗腫瘤藥物百里醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞的效應(yīng),觀察不同濃度下百里醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,研究對(duì)EMT調(diào)控蛋白和癌癥轉(zhuǎn)移的影響。研究百里醌用于治療宮頸癌的機(jī)制和可能性,為宮頸癌的臨床治療提供新靶標(biāo)、新思路。方法:(1)對(duì)宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa,用不同劑量(終濃度0μM/mL、1μM/mL、5μM/mL、10μM/mL、20μM/mL、40μM/mL)的百里醌,作用不同時(shí)間(12h、36h、24h和48h)后,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)百里醌對(duì)細(xì)胞的毒性作用。(2)用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用下,對(duì)宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的生長(zhǎng)、侵襲、遷移的影響。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后,對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后,EMT分子以及凋亡相關(guān)不同基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。(5)Western Blot檢測(cè)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后,不同EMT分子以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。(6)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、1μM/mL、2μM/mL、4μM/mL、8μM/mL、16μM/mL)作用宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后,用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)TQ是否作用于Twist1和Zeb1基因的啟動(dòng)子。(7)百里醌不同劑量(終濃度0μM/mL、5μM/mL)作用于宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa后,檢測(cè)TQ對(duì)Twist1的啟動(dòng)子是否有甲基化作用。結(jié)果:(1)通過(guò)CCK-8檢測(cè),結(jié)果顯示TQ劑量在5μM/mL或者較大劑量,作用時(shí)間在24h或者更長(zhǎng),對(duì)宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa有明顯的細(xì)胞毒性作用,并呈劑量依賴性。(2)通過(guò)實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀檢測(cè),百里醌在5μM/mL或更大的劑量下可抑制宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。(3)流式細(xì)胞儀結(jié)果表明TQ可以增加宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的細(xì)胞凋亡率。(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),TQ不同劑量(終濃度5μM/mL和10μM/mL)作用24h后,宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中Twist1,Zeb1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低,并且E-Cadherin的表達(dá)升高。在CaSki細(xì)胞系中,還影響了Vimentin和MMP-9,在SiHa細(xì)胞系還影響了Slug。Bax和Bcl-2在宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中都沒(méi)有明顯變化。(5)Western blot結(jié)果顯示,TQ不同劑量(終濃度5μM/mL和10μM/mL)作用36h后,宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中Twist1,Zeb1的蛋白水平降低,而E-Cadherin的表達(dá)水平升高。但宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa中凋亡相關(guān)蛋白PARP,Caspase-3,Caspase-9的蛋白水平幾乎沒(méi)有變化。(6)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析表明百里醌分別減少了Twist1和Zeb1的啟動(dòng)子活性,并且RLU的減少與TQ劑量的增加存在依賴性,證明Twist1和Zeb1可能是百里醌的直接作用靶點(diǎn)。(7)通過(guò)百里醌處理(終濃度5μM/mL,24h)后的宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa,Twist1基因近端啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化后焦磷酸測(cè)序,數(shù)據(jù)分析有輕微增加。結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明,百里醌除了明顯抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖,還抑制了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。百里醌靶向作用于EMT-TFs,如Twist1和Zeb1,是抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。百里醌增加宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率,但機(jī)制尚不明確。因此,百里醌可能是一種潛在的治療宮頸癌的化療藥物,但對(duì)于百里醌發(fā)展和成為一種臨床藥物,仍需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究。
【學(xué)位單位】:西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類】:R737.33
【部分圖文】:

細(xì)胞毒性,宮頸癌細(xì)胞


1 CCK-8檢測(cè)百里醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的細(xì)胞毒性作用。我們使用CCK-8來(lái)進(jìn)行細(xì)胞毒性分析,表明百里醌對(duì)宮頸癌細(xì)胞CaSki和SiHa細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有劑量依賴性(如表2 A&B,圖2A&B)。在CaSki細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)12小時(shí)的百里醌處理后,它顯示了劑量依賴效應(yīng),在24小時(shí),36小時(shí)和48小時(shí)之后同樣如此,各用藥組與對(duì)照組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)(如表2A,圖2A)。然而在SiHa細(xì)胞中,百里醌處理12小時(shí)后,沒(méi)有明顯的影響,但是進(jìn)行了24小時(shí)

百里醌通過(guò)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Twist1和Zeb1抑制宮頸癌細(xì)胞系CaSki和SiHa的侵襲轉(zhuǎn)移


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