卵巢癌(ovarian cancer)是導(dǎo)致女性死亡的第五種最常見的癌癥,由于癥狀出現(xiàn)較晚,大多數(shù)患者診斷為晚期(III-IV),這些患者的5年相對生存率僅為29%。其組織學(xué)類型較多,最常見的類型為上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer)。晚期疾病患者通常存在腹水積聚,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)擴(kuò)散。標(biāo)準(zhǔn)的治療方法包括手術(shù)切除腫瘤以縮小腫瘤體積,然后以鉑為基礎(chǔ)的化療。此法雖能提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性,但長期化療會(huì)引起免疫抑制,升高外周耐受性,導(dǎo)致耐藥的獲得或產(chǎn)生,因此迫切需要發(fā)展新的治療手段。腫瘤免疫治療是腫瘤治療學(xué)發(fā)展的方向之一,指通過激活或增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤免疫反應(yīng),控制或消除腫瘤細(xì)胞的方法,免疫治療的目的是發(fā)展聯(lián)合方法,在增強(qiáng)免疫的同時(shí)防止局部免疫抑制,免疫治療的進(jìn)展為卵巢腫瘤的治療提供了廣闊的前景。免疫檢查點(diǎn)是存在于免疫系統(tǒng)中的抑制性信號通路,對外周組織中免疫反應(yīng)強(qiáng)度、持續(xù)性予以調(diào)節(jié),防止組織損傷,并在維持自身抗原耐受性的過程中發(fā)揮作用。近年研究發(fā)現(xiàn),免疫檢查點(diǎn)在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。腫瘤免疫逃逸是指腫瘤細(xì)胞通過各種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊而生長和轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象,是腫瘤生存和發(fā)展的重要策略。程序性死亡配體受體-1(PD-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、吲哚胺2,3-雙加氧化酶-1(IDO-1)、淋巴細(xì)胞活化基因-3(LAG-3)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)等,它們被稱為免疫檢查點(diǎn),可抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化,最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。人類PD-1是由位于染色體2q37上的PDCD1基因編碼的一種Ⅰ型跨膜蛋白,由288個(gè)氨基酸殘基組成,屬于免疫球蛋白CD28家族,PD-1蛋白是一種分子量為55-60 kDa的Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外IGV樣區(qū)、疏水性跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。PD-1胞內(nèi)區(qū)的C-端和N-端氨基酸殘基有兩個(gè)獨(dú)立的磷酸化位點(diǎn):免疫受體酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受體酪氨酸基開關(guān)基序(ITSM)。PD-L1(B7-H1或CD274)是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)PD-1配體,屬于B7家族,位于人類染色體9p24.2上,其氨基酸結(jié)構(gòu)與PD-1類似。當(dāng)PD-1與PD-L1結(jié)合時(shí),ITSM區(qū)域被磷酸化,激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路,抑制免疫細(xì)胞的激活,從而減少免疫細(xì)胞分泌抗體和細(xì)胞因子,甚至耗盡免疫細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)有效的免疫抑制。TIM-3又稱HAVCR2,屬于TIM基因家族。在人類中,TIM家族包括TIM-1、TIM-3和TIM-4,位于染色體5q33.2上。它們具有相似的結(jié)構(gòu):可變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(IGV)、胞外區(qū)不同長度的糖基化粘蛋白結(jié)構(gòu)域和單個(gè)跨膜區(qū),除了TIM-4外,所有TIM分子還含有一個(gè)C末端的磷酸化細(xì)胞質(zhì)尾。具有保守的基于酪氨酸的信號基序GAL-9是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的配體,它是一種糖結(jié)合蛋白,能特異性識別TIM-3免疫球蛋白可變區(qū)N-糖鏈的結(jié)構(gòu),TIM-3與Gal-9結(jié)合后促使鈣離子內(nèi)流到Th1細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前,關(guān)于PD-1和TIM-3在上皮性卵巢癌中的聯(lián)合研究較少。有研究表明,在其他多種惡性腫瘤如胃癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)上共表達(dá)PD-1及TIM-3,聯(lián)合阻斷TIM-3和PD-1往往比單獨(dú)阻斷PD-1產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果。目的本研究擬通過免疫組化和qRT-PCR法檢測PD-1與TIM-3在不同卵巢組織中的蛋白陽性表達(dá)率及mRNA的表達(dá)情況,從而為以PD-1和TIM-3為聯(lián)合靶點(diǎn)進(jìn)行抗癌治療提供思路和契機(jī)。研究對象和實(shí)驗(yàn)方法1.研究對象:收集2016年9月至2018年3月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院并行手術(shù)切除卵巢組織的患者共100例,年齡為(13~69)歲,中位年齡48歲。其中正常卵巢上皮組織30例(正常組),標(biāo)本來源于因?qū)m頸癌或其他良性疾病行附件切除,術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為正常卵巢上皮組織;卵巢良性上皮性腫瘤組織30例(良性組),上皮性卵巢癌組織40例(惡性組)。所有病例術(shù)前均未接受放化療、藥物等治療,除外其他臟器轉(zhuǎn)移性癌,術(shù)后組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診。所有組織收集通過鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并取得患者知情同意。2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)采用免疫組化SP法分別檢測正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織及上皮性卵巢癌組織中PD-1和TIM-3蛋白的陽性表達(dá)率。(2)采用qRT-PCR法分別檢測正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織及上皮性卵巢癌組織中PD-1和TIM-3 mRNA的表達(dá)水平。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用x±s表示,偏態(tài)分布計(jì)量資料用M(中位數(shù))表示,計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示。應(yīng)用R×Cχ~2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析三種卵巢上皮性組織中PD-1及TIM-3蛋白陽性表達(dá)率及兩者的表達(dá)與不同臨床病理參數(shù)的關(guān)系。應(yīng)用單因素方差分析比較正常組、良性組及惡性組卵巢組織中PD-1及TIM-3 mRNA表達(dá)水平,組間兩兩比較采用Dunnett’T3法。PD-1及TIM-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析,設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.三組卵巢組織中PD-1、TIM-3蛋白的表達(dá)PD-1及TIM-3蛋白陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中,顯微鏡下呈棕黃色顆粒狀分布。PD-1蛋白在正常組、良性組和惡性組中的陽性表達(dá)率分別為6.7%(2/30)、36.7%(11/30)、75%(30/40),惡性組的陽性表達(dá)率明顯高于正常組和良性組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),良性組的陽性表達(dá)率高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。TIM-3蛋白在正常組、良性組和惡性組中的陽性表達(dá)率分別為10%(3/30)、43.3%(13/30)、85.0%(34/40),惡性組的陽性表達(dá)率明顯高于正常組和良性組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),良性組的陽性表達(dá)率高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。2.PD-1和TIM-3蛋白陽性表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系PD-1蛋白在FIGO分期I-II期和III-IV期上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率分別為50%(7/14)、88.5%(23/26),隨著手術(shù)病理分期增高,PD-1蛋白的陽性表達(dá)率增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌組織PD-1蛋白的陽性表達(dá)率為88.9%(16/18),顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌組織PD-1蛋白的陽性表達(dá)率50.0%(6/12),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。但PD-1蛋白的表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)分型和組織分化程度無關(guān)(P0.05)。TIM-3蛋白在高、中、低分化上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率分別為40.0%(2/5)、83.3%(10/12)、95.7%(22/23),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌組織TIM-3蛋白的陽性表達(dá)率為100.0%(18/18),顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌組織TIM-3蛋白的陽性表達(dá)率66.7%(8/12),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。但TIM-3蛋白表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)分型和FIGO分期無關(guān)(P0.05)。3.三組卵巢組織中PD-1、TIM-3 mRNA的表達(dá)正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織和上皮性卵巢組織中PD-1 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.037±0.019、0.149±0.039和0.678±0.275。惡性組中PD-1 mRNA的相對表達(dá)量高于良性組和正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。良性組中PD-1 mRNA的相對表達(dá)量高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織和上皮性卵巢組織中TIM-3 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.037±0.020、0.179±0.076和0.665±0.271。惡性組中TIM-3 mRNA的相對表達(dá)量高于良性組和正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。良性組中PD-1 mRNA的相對表達(dá)量高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.PD-1和TIM-3在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman相關(guān)分析得出,PD-1蛋白和TIM-3蛋白在上皮性卵巢組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.566,P㩳0.001)。結(jié)論1.在上皮性卵巢癌中PD-1及TIM-3蛋白陽性表達(dá)及其mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常卵巢上皮組織及良性上皮性卵巢腫瘤組織。2.在上皮性卵巢癌中PD-1蛋白表達(dá)水平可以預(yù)測臨床病理分期和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移;TIM-3蛋白表達(dá)水平可以預(yù)測組織分化程度和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移。3.在上皮性卵巢癌中PD-1及TIM-3表達(dá)呈正相關(guān),可能協(xié)同參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

圖 3.1 三種組織中 PD-1 蛋白陽性表達(dá)（SP，×400 倍）注：A1 正常卵巢組織 A2 漿液性囊腺瘤 A3 黏液性囊腺瘤 A4 漿液性囊腺癌 A5 黏液性囊腺癌圖 3.2 三種組織中 TIM-3 蛋白陽性表達(dá)（SP，×400 倍）注：B1 正常卵巢組織 B2 漿液性囊腺瘤 B3 黏液性囊腺瘤 B4 漿液性囊腺癌 B5 黏液性囊腺癌3.1.2 PD-1 和 TIM-3 蛋白陽性表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系PD-1蛋白在FIGO分期I-II期和III-IV期上皮性卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率分別為 50%（7/14）、88.5%（23/26），隨著手術(shù)病理分期增高，PD-1 蛋白的陽性表達(dá)率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P㩳0.05）。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)有淋巴結(jié)

3.1.1.2 三組卵巢組織中 PD-1、TIM-3 蛋白陽性表達(dá)定位PD-1 蛋白及 TIM-3 蛋白陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，顯微鏡下呈棕黃色顆粒狀分布。（見圖 3.1 和圖 3.2）圖 3.1 三種組織中 PD-1 蛋白陽性表達(dá)（SP，×400 倍）注：A1 正常卵巢組織 A2 漿液性囊腺瘤 A3 黏液性囊腺瘤 A4 漿液性囊腺癌 A5 黏液性囊腺癌

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本文編號：2819369