【摘要】：目的:初步探究性腺外卵泡刺激素受體(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)在小鼠子宮內(nèi)膜的定位、表達變化及其在妊娠期小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用。方法:1、運用免疫組織化學(xué)方法觀察分析小鼠妊娠期(D1-D9天)子宮內(nèi)膜組織中FSHR的表達部位及表達水平的變化。2、使用人工誘導(dǎo)蛻膜化技術(shù)構(gòu)建小鼠人工蛻膜化模型,分析FSHR的表達是否受人工蛻膜化的影響。3、構(gòu)建去卵巢及用E_2、P_4激素處理的子宮模型,觀察經(jīng)激素處理后FSHR在小鼠子宮內(nèi)膜表達的變化。4、通過離體實驗對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞進行分離、培養(yǎng)及體外誘導(dǎo),檢測在離體狀態(tài)蛻膜化過程中FSHR和FSH表達水平的變化。5、運用MTS法,觀察不同濃度的重組FSH對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的影響。6、運用實時熒光定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡技術(shù)觀察FSH對小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響。7、采取RNA干擾技術(shù),觀察分析FSHR對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化的影響。8、運用蛋白免疫印跡技術(shù)觀察分析FSH對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞Erk1/2和AKT信號通路的影響。結(jié)果:1、通過免疫組織化學(xué)方法檢測顯示,在正常妊娠D1-D4天,FSHR主要定位于子宮內(nèi)膜的腔上皮和腺上皮細胞。隨著蛻膜化的進展(妊娠D5-D9天),植入位點FSHR的表達量均明顯增加,且主要表達于圍繞胚胎的子宮蛻膜組織,而非植入位點FSHR主要定位于腔上皮和腺上皮細胞。2、在在體人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中,假孕第4天時給予一側(cè)子宮角注射芝麻油,與非油側(cè)相比,注射芝麻油一側(cè)的子宮角隨妊娠時間的延長(D5-D9天)外形逐漸增大,而非油側(cè)子宮角外形沒有明顯的變化。在人工誘導(dǎo)蛻膜化的子宮組織中,FSHR表達量隨妊娠天數(shù)的增加(D5-D9天)而逐漸增加,且主要表達于蛻膜細胞,而非油側(cè)子宮組織中,FSHR沒有明顯變化,主要表達于腔上皮和腺上皮細胞。3、免疫組織化學(xué)方法檢測顯示,摘除卵巢的子宮組織,經(jīng)E_2處理12h和24h后,子宮組織中FSHR主要表達腔上皮和腺上皮細胞,而經(jīng)E_2和其拮抗劑Tam共同處理后,FSHR在子宮組織中幾乎無表達;經(jīng)P_4處理12h和24h的子宮組織中,FSHR表達于腔上皮、腺上皮細胞以及子宮基質(zhì)細胞,而經(jīng)P_4與其拮抗劑RU486聯(lián)合處理后FSHR僅表達于腔上皮和腺上皮細胞。4、細胞免疫熒光染色檢測顯示,體外分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞表達波形蛋白(Vimentin)而不表達角形蛋白(Cytokeratin)。在體外經(jīng)E_2和P_4聯(lián)合培養(yǎng)24h、48h、72h后,免疫熒光染色結(jié)果顯示,FSHR蛋白顯著表達于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的胞漿和胞膜;蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,蛻膜化標記分子Cyclin D3蛋白和prl8a2 mRNA的表達水平在體外培養(yǎng)48h、72h后,與24h相比較,均顯著性增加(P0.05或0.01)。同時,Fshb mRNA和Fshr mRNA的表達水平,也隨時間的延長而逐漸增加(P0.01)。5、通過MTS實驗觀察分析,培養(yǎng)96h后,與Control組相比,3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml的FSH均明顯促進基質(zhì)細胞的增殖(P0.05或0.01),而300ng/ml、600ng/ml、1000ng/ml的FSH,與Control組相比,均明顯抑制了基質(zhì)細胞的增殖(P0.05或0.01)。10ng/ml的FSH在體外培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后,與0h相比,均能明顯促進基質(zhì)細胞增殖(P0.05或0.01)。6、運用蛋白免疫印跡法和實時熒光定量PCR檢測顯示,經(jīng)FSH、E_2+P_4、E_2+P_4+FSH處理子宮基質(zhì)細胞48h和72h后,蛻膜化標記分子Cyclin D3蛋白的表達水平,與Control組相比均明顯增加(P0.05或0.01)。同時,與E_2+P_4組相比,E_2+P_4+FSH組中蛻膜化標記分子prl8a2 mRNA的表達量顯著增高(P0.01)。7、與Blank Control組相比,轉(zhuǎn)染FSHR siRNA+FSH組的Fshr mRNA和FSHR蛋白表達水平均明顯下降(P0.05或0.01),而轉(zhuǎn)染Scramble siRNA組無明顯變化。FSHR基因受干擾的同時,蛻膜化的標記分子prl8a2 mRNA和Cyclin D3蛋白的表達水平也均相應(yīng)下降(P0.05或0.01),提示FSHR基因的下調(diào)能明顯抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化的進程。8、蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與0min相比,隨著時間延長,10ng/ml FSH處理子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞,能明顯增加AKT和Erk1/2磷酸化水平,至60min時,AKT和Erk1/2磷酸化水平均達到最大。結(jié)論:在妊娠早期,FSHR時空性的表達于妊娠小鼠子宮內(nèi)膜母胎界面,且其表達部位和表達量變化受E_2、P_4及子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響;小劑量FSH可促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的增殖和蛻膜化;FSHR干擾后,子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的蛻膜化受到顯著的抑制,說明FSHR具有促進子宮內(nèi)膜蛻膜化的作用。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714
【圖文】：

圖 1.FSHR 在小鼠妊娠 D1-D4 天子宮內(nèi)膜的定位與表達Figure 1. Localization and expression of FSHR in the mice uteri during pregnancy D1-D4A.陽性對照為附睪組織，B.陰性對照為妊娠第 3 天子宮組織；C-F 分別為妊娠第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 4 天子宮組織，A1-F1 放大倍數(shù)（×100）；A2-F2 分別為 A1-F1 圖中方框部位的放大圖（×400）。GE：腺上皮;LE：腔上皮;S：基質(zhì)。

圖 2 FSHR 在小鼠妊娠 D5-D9 天植入位點和非植入位點的定位與表達Figure 2. Localization and expression of FSHR in mice implanted and non-implanted sites during D5-D9 days of pregnancyA-E 分別為妊娠第 5 天、第 6 天、第 7 天、第 8 天、第 9 天子宮組織 FSHR 免疫組化染色圖；

圖 3 FSHR 在人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮內(nèi)膜中的表達與定位Figure 3. Expression and localization of FSHR in artificially induced decidualized mouseendometriumA-E 為假孕第 5 天、第 6 天、第 7 天、第 8 天、第 9 天子宮組織；A1-E1 分別為假孕 D5-D9 的子宮外形圖；

【參考文獻】

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本文編號：2806622