【摘要】：研究背景:早發(fā)型子癇前期(EO-PE)是發(fā)病于34周之前的一種妊娠特有的并發(fā)癥,其發(fā)病原因眾多,目前公認的滋養(yǎng)細胞侵襲力不足是其主要原因之一。細胞侵襲依賴于細胞骨架重塑和侵襲結(jié)構(gòu)的形成,ACTN4作為肌動蛋白主要維持細胞骨架的完整性和調(diào)節(jié)細胞的運動。本課題旨在研究ACTN4在EO-PE胎盤滋養(yǎng)細胞中的表達,研究并探討ACTN4表達異常對滋養(yǎng)細胞功能的影響,并探索其調(diào)控機制,以期為闡明子癇前期發(fā)病機制提供新的研究方向,并為子癇前期的預(yù)測和治療提供潛在的靶點。方法:利用免疫組化法和Western blot法檢測ACTN4在正常胎盤組織和EO-PE胎盤組織中的表達和定位,并分離原代滋養(yǎng)細胞,檢測其在原代滋養(yǎng)細胞中的表達。然后用siRNA干擾方法對ACTN4進行敲降,并用CCK-8法、流式細胞周期和EdU法檢測敲降細胞的增殖能力。用Western blot法檢測敲降A(chǔ)CTN4后對AKT/GSK3β通路的影響。利用Co-IP法和胞質(zhì)、胞膜分離法檢測ACTN4對AKT膜轉(zhuǎn)移及其活化的作用。用免疫熒光法和Co-IP法檢測E-cadherin敲降細胞中ACTN4和β-catenin的定位和互作情況。用TRITC-phalloidin法檢測敲降E-cadherin和(或)敲降A(chǔ)CTN4的JEG3細胞骨架的改變。并用Matrigel侵襲和Transwell遷移法檢測各組細胞的侵襲和遷移能力。最后,通過尾靜脈注射ACTN4干擾腺病毒構(gòu)建ACTN4敲降孕鼠模型,測量孕鼠血壓和胎盤、胎鼠重量情況,和胎盤、腎臟組織病理結(jié)構(gòu)的變化及胎盤組織中ACTN4和AKT通路蛋白的表達情況。結(jié)果:免疫組化法和Western blot法結(jié)果顯示,與正常胎盤滋養(yǎng)細胞相比,ACTN4在EO-PE胎盤滋養(yǎng)細胞中異常低表達。CCK-8法、流式細胞周期法和EdU法結(jié)果均顯示敲降A(chǔ)CTN4顯著降低HTR8/SVneo細胞的增殖能力,且Western blot法結(jié)果顯示敲降A(chǔ)CTN4明顯抑制AKT/GSK3β通路的活性。Co-IP法和胞質(zhì)、胞膜分離法結(jié)果顯示ACTN4和AKT之間存在相互作用,且ACTN4對于AKT膜轉(zhuǎn)移并活化至關(guān)重要。另外,免疫熒光法、Co-IP法和Western blot法結(jié)果顯示,E-cadherin敲降的JEG3細胞中,ACTN4和β-catenin相互作用關(guān)系明顯增強,且這種增強主要表達定位于細胞偽足。TRITC-phalloidin法和侵襲遷移法結(jié)果顯示,E-cadherin敲降的JEG3細胞骨架高度重塑且侵襲遷移能力明顯增強,而在這基礎(chǔ)之上再下調(diào)ACTN4的表達時,細胞骨架出現(xiàn)解聚,侵襲遷移能力隨之明顯減弱。最后,注射ACTN4干擾腺病毒的孕鼠,血壓出現(xiàn)明顯升高,胎盤和胎鼠重量出現(xiàn)明顯下降,胎盤連接層面積和增殖細胞均出現(xiàn)明顯減少,腎臟腎小球出現(xiàn)明顯腫脹,胎盤ACTN4和AKT通路蛋白活性均明顯下降。結(jié)論:ACTN4主要表達于胎盤的CTB細胞和iEVT細胞,且在EO-PE胎盤滋養(yǎng)細胞中的表達較正常組明顯降低。ACTN4通過調(diào)控AKT的膜轉(zhuǎn)位及活性進而調(diào)控滋養(yǎng)細胞的增殖能力,且ACTN4-β-catenin作為細胞骨架及細胞偽足形成的關(guān)鍵,參與滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移能力,受E-cadherin負性調(diào)節(jié)。ACTN4敲降孕鼠出現(xiàn)胎盤化異常和PE樣表型改變。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R714.244
【圖文】：

23圖 1. ACTN4 在胎盤組織中的表達模式Figure 1. ACTN4 expression pattern in placentaA, 免疫組化法檢測 ACTN4 在早孕組織中的表達模式。a, b, d, e 為絨毛組織，c, f 為蛻膜組織，AV, 錨定絨毛；FV，漂浮絨毛；CCT，細胞柱滋養(yǎng)細胞；STB，合體滋養(yǎng)細胞；CTB，細胞滋養(yǎng)層細胞；iEVT, 間質(zhì)絨毛外滋養(yǎng)細胞。B，免疫組化法檢測 ACTN4 在晚孕正常胎盤（a, c, e, g）和 EO-PE 胎盤（b, d, f, h）組織中的表達模式。BP, 胎盤基底面；DS，蛻膜面。C，Western blot 法檢測 ACTN4 在早孕絨毛組織和正常足月胎盤組織中的蛋白表達。β-actin 作為內(nèi)參；NS，無顯著差異。D，Western blot 法檢測 ACTN4 在正常胎盤組織和 EO-PE 胎盤組織中的蛋白表達。*P < 0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

圖 2. 正常原代滋養(yǎng)細胞和 EO-PE 原代滋養(yǎng)細胞 ACTN4 的蛋白表達和骨架改變Figure 2. ACTN4 expression and actin filaments in normal CTBs and EO-PE CTBsA，免疫熒光法鑒定原代 CTB 細胞的純度。DAPI，染核。B，Western blot 法檢測 ACTN4在正常原代 CTB 細胞（N-CTB）和 EO-PE 原代 CTB 細胞（EO-PE-CTB）中的表達，β-actin作為蛋白內(nèi)參，**P < 0.01，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。C，TRITC-phalloidin 檢測滋養(yǎng)細胞骨架（actin-filament, F-actin）的改變。A, IF staining of CK7 (green) and vimentin (red) in isolated cells from human term placentas.Nuclei were counterstained by DAPI (blue). B, Western blotting of ACTN4 in primary CTB cellsisolated from normal and EO-PE placentas. Data are presented as the means±SEM. **P < 0.01. C,TRITC-Phalloidin staining on primary CTBs isolated from normal (N-CTB) and early-onset PE(EO-PE-CTB) placentas. All data are of 3 independent experiments performed in triplicate.3 討論早期胎盤的發(fā)育及滋養(yǎng)細胞的分化是成功妊娠的關(guān)鍵[6]。CTB 細胞分化異常影響了滋養(yǎng)細胞對子宮的侵襲，從而導(dǎo)致螺旋動脈重構(gòu)異常和胎盤灌注不足[7,8]。

圖 1. ACTN4 調(diào)節(jié) HTR8/SVneo 細胞增殖能力Figure 1. ACTN4 regulates trophoblast proliferationA，Western blot 法檢測 ACTN4 在 HTR8/SVneo、JEG3 和 JAR 細胞中的蛋白表達。B，Western blotting 法檢測 ACTN4 的干擾效率。C，CCK-8 法檢測 ACTN4 敲降 0 h，24 h，48 h，72 h 后細胞的增殖能力。D，流式細胞周期法檢測敲降 ACTN4 48 h 后細胞周期的分布。E，EdU 法檢測敲降 48 h 后細胞的 DNA 合成能力。NC，無顯著差異，*P < 0.05，**P < 0.01，***P< 0.001，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。A, Western blotting of ACTN4 in HTR-8/SVneo, JAR, and JEG3 cells. B, Interferenceefficiency of siRNAs targeting ACTN4 in HTR-8/SVneo cells was assessed by Western blotting. NC,negative control. C, CCK-8 assay on HTR-8/SVneo cells after 0, 24, 48, and 72 h of si-ACTN4#1and si-ACTN4#2 transfection. D, Cell cycle analysis of HTR-8/SVneo cells by flow cytometry after48 h of si-ACTN4#1 and si-ACTN4#2 transfection. E, EdU (pink) staining on HTR-8/SVneo cellsafter 48 h of si-ACTN4#1 and si-ACTN4#2 transfection. Nuclei were counterstained with DAPI(blue). Scale bars, 200 mm. All data are means ± SEM of 3 independent experiments performed intriplicate. NS, nonsignificant. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

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本文編號：2800100