發(fā)布時間：2020-08-20 23:37

【摘要】：卵巢癌,女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一,其致死率居高不下。2016年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全美新發(fā)病例22,280例,死亡病例14,240例。卵巢癌最常見組織學類型為上皮性癌,約占90%。若早期發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢,5年生存率可達70%-90%。然而,由于缺乏特異性標記物及特異性臨床癥狀,卵巢癌難以早期發(fā)現(xiàn),大多數(shù)患者確診時已達晚期,預后極差,總體5年生存率僅有20%-30%。因此,尋找早期檢測卵巢癌的新靶點及深入研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制以期尋找新的治療策略迫在眉睫。MicroRNA(miRNA),是由19-25核苷酸組成的單鏈。最初在1989年由Vi ctor在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)基因lin-4可以抑制另一個基因lin-14,因此lin-4被認為是一種調(diào)控蛋白。在1993年,Rosalind Lee和Phonda Feinbaum成功克隆出lin-4并將其鑒定為一種小的非蛋白質(zhì)編碼RNA。他們發(fā)現(xiàn)microRNA lin-4通過特異雜交結合到lin-14信使RNA的非翻譯區(qū)(3' UTR)形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)誘導目標mRNA的降解或抑制蛋白翻譯從而下調(diào)lin-14蛋白表達。miRNA高度保守,廣泛存在于人類、植物、動物和一些病毒中,很多研究報道已證實miRNA在上皮性卵巢腫瘤中扮演著重要的角色。它們在多種癌癥常存在異常表達,并通過改變靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯參與信號通路的微調(diào)從而發(fā)揮生物學功能。miR-424-5p是內(nèi)源性microRNA集群中的一員,位于人類染色體Xq26.3。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在許多類型的腫瘤中存在表達異常,如胃癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、食管鱗狀細胞癌、宮頸癌、胰臟癌,包括卵巢癌。然而,它在不同組織中扮演著癌基因或抑癌基因兩種不同角色。據(jù)報道,與胰腺癌組織中的過表達相比,miR-424-5p在肝細胞癌、食管鱗狀細胞癌和宮頸癌的水平均呈現(xiàn)不同程度的表達下調(diào)。目前對于miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的研究甚少,盡管通過全基因組miRNAs表達譜差異發(fā)現(xiàn)miR-424-5p在卵巢癌中表達下調(diào),但也有報道提示miR-424-5p高表達可以促進卵巢癌耐藥和腫瘤進展,這可能跟卵巢癌異質(zhì)性有關或選用了不同來源的卵巢癌細胞引起的相反結論。對于這樣的差異引起了我們課題組的興趣,miR-424-5p在上皮性卵巢癌中到底扮演了怎樣的角色呢?是抑癌基因還是癌基因?還是不同條件下的雙重角色?目前對于miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的生物學行為及作用機制少有報道。因此,基于上述研究背景,我們有必要探索miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的表達及作用,試圖尋找新的靶基因和調(diào)控機制,為卵巢癌的基因治療提供潛在的理論依據(jù)。本課題研究內(nèi)容主要包括以下部分:第一章:miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的表達及臨床病理之間的關系;第二章:miR-424-5p靶基因CCNE1的預測及鑒定;第三章:miR-424-及其靶基因?qū)ι掀ば月殉舶┥飳W的影響及調(diào)控機制的初步探討第一章m i R-424-5p及CCNE-1在上皮性卵巢癌中的表達及臨床病理特征的關系研究背景及目的:目前,關于上皮性卵巢癌的起源及進展的分子機制尚未完全明確。MicroR NA(miRNAs)在癌癥中的研究越來越引起國內(nèi)外學者的關注,并且已證實其在卵巢腫瘤中也起著重要作用。miR-424-5p在許多癌癥中扮演不同角色,而在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制,迄今為止鮮有報道。本研究目的是檢測miR-424-5p在上皮性卵巢癌組織中及不同卵巢癌細胞系中的表達,分析其與卵巢癌臨床病理特征之間的關系及預后價值,探討miR-424-5p作為上皮性卵巢癌早期診斷的一項新靶標的可能性。研究方法:收集山東大學齊魯醫(yī)院經(jīng)手術和術后病理證實的的上皮性卵巢癌新鮮組織(實驗組)83例及正常卵巢上皮組織(對照組)19例,每份標本分成兩份,一份行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測,另一份行待實驗第二部分行免疫組化檢測CCNE1的表達。納入研究的患者術前均未接受任何放化療。1.采用實時熒光定量PCR檢測不同上皮性卵巢癌組織中miR-424-5p mRNA表達水平,并分析miR-424-5p與臨床病理參數(shù)之間的關系。2.應用Kaplan-Meier繪制生存曲線,并分析miR-424-5p與上皮性卵巢癌預后相關的兩個指標總生存率(OS)及無進展生存率(RFS)的相關性。3.采用實時熒光定量PCR檢測miR-424-5p在3種不同卵巢癌細胞株HO8910、A2780、SKOV3和永生化正常卵巢上皮細胞株HOSEpiC中的表達差異。研究結果:1.qRt-PCR結果顯示,miR-424-5p在上皮性卵巢癌組織中的表達水平(0.3649 ± 0.2709)明顯低于正常卵巢上皮組織(1.0000 ± 0.1711),差異顯著(**p0.01)。和27例低級別漿液性上皮性卵巢癌相比,miR-424-5p表達含量在44例高級別漿液性上皮性卵巢癌明顯下調(diào),二者差異顯著(**p0.01)。腫瘤分化程度低,期別越晚,淋巴轉(zhuǎn)移,腫瘤越大,miR-424-5p表達含量越低,差異具有統(tǒng)計學意義(p = 0.0334,0.0036,0.0398,0.0174),與患者年齡、腹水和血清CA125水平無關。2.Kaplan-Meier生存分析結果顯示,miR-424-5p高表達與總生存率(OS)(P=0.012)及無進展生存率(RFS)(P=0.020)密切相關。3.qRT-PCR結果顯示,與永生化正常卵巢上皮細胞株HOSEpiC相比,miR-424-5p在卵巢癌細胞株Ho8910,SKOV3,A2780表達均下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(**p0.01)。研究結論及意義:miR-424-5p在上皮性卵巢癌組織及癌細胞系中的表達明顯下降,且miR-424-5p與上皮性卵巢癌的病理分級、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤大小密切相關,miR-424-5p高表達患者的總生存率和無進展生存率明顯高于miR-424-5p低表達患者,提示miR-424-5p表達缺失在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,對判斷預后具有重要價值。第二章miR-424-5p靶基因CCNE1的預測及鑒定研究背景及目的:miRNA是一類長度僅有約22nt的單鏈內(nèi)源非編碼小RNA,通過與互補的mRNA選擇性的抑制靶蛋白的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn),每個哺乳動物的miRNA可調(diào)控約200個靶基因。但到目前為止,對于許多miRNA的功能仍然認識不夠,其原因可能是明確的miRNA靶基因數(shù)量較少,而靶基因的預測和鑒定的難度又頗大�，F(xiàn)階段,基于計算機算法在內(nèi)的許多公共數(shù)據(jù)庫可以有助于預測miRNA的種子區(qū)結合位點,該種子區(qū)為miRNA進化過程中最保守的片段,從第2到第8個核苷酸參與互補mRNA 3'-UTR上的靶位。我們前期研究發(fā)現(xiàn),miR-424-5p在上皮性卵巢癌組織中表達下調(diào),提示miR-424-5p可能作為抑癌基因參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。那么miR-424-5p在卵巢癌中是通過哪個靶基因來發(fā)揮它的生物學功能的?因此,我們擬通過多種生物信息學算法的共同交集,來提高靶基因預測正確的成功率。根據(jù)前述研究中miR-424-5p在不同細胞系中的表達量的不同,選取合適的細胞系對miR-424-5p過表達或者抑制進行相關研究,并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進一步提高預測結果的準確性。研究方法:1.應用三種生物信息學(miRDB,TargetscanandmiRanda)運算方法取各自前50名預測分數(shù)最高的交集進行初步篩選。2.共轉(zhuǎn)染miR-424-5p模擬物對A2780細胞過表達及miR-424-5p抑制物來降低Ho8910細胞miR-424-5p表達,通過qRT-PCR確定轉(zhuǎn)染效率后,對三個候選靶基因(SLC9A6,AN03和CCNE1)進行驗證。3.構建CCNE-1的3'-UTR的熒光素酶表達質(zhì)粒pGL3-CCNE1,與miR-424-5p的模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染A2780細胞或Ho8910細胞,觀察野生組(WT)和突變組(MU)miR-424-5p對pGL3-CCNE1的熒光素酶活性的影響,進一步判斷miR-424-5p是否直接調(diào)控CCNE1 3'-UTR區(qū)。4.為了研究miR-424-5p對CCNE1表達水平的影響,通過qRT-PCR、Western Blot檢測被轉(zhuǎn)染后的A2780和Ho8910中CCNE1的蛋白及mRNA表達水平,來驗證二者是否相關性。5.最后,利用免疫組化及qRT-PCR對CCNE1在上皮性卵巢癌中的表達進行檢測,進一步確認CCNE1與miR-424-5p之間在卵巢癌中是否相關。研究結果:通過3種不同生物信息學方法(miRDB,TargetscanandmiRanda)選取分數(shù)在前50的靶基因進行交集運算,得到SLC9A6,AN03andCCNE1為共同靶基因。1.將miR-424-5p的模擬物和抑制劑的對照組分別轉(zhuǎn)染A2780、Ho8910細胞4小時后在熒光顯微鏡觀察可見帶綠色熒光的細胞數(shù)占總細胞數(shù)達90%以上。qRT-PCR分析結果顯示,以miR-NC組miR-424-5p表達量作為1,miR-424-5p 轉(zhuǎn)染組 A2780 細胞中 miR-424-5p 表達量上調(diào) 7.559±0.428 倍,差異顯著(**P0.01);以inhibitorNC組細胞中miR-424-5p表達量作為1,miR-424-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染組 Ho8910 細胞中 miR-424-5p 表達量下調(diào) 0.558±0.060倍,差異具有統(tǒng)計學意義(**p0.01)2.qRT-PCR分析結果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染miR-424-5p模擬物的A2780細胞和轉(zhuǎn)染miR-424-5p抑制劑的Ho8910細胞中,SLC9A6,AN03 mRNA水平較對照組相比差異無明顯統(tǒng)計學意義。而Western Blot和qRT-PCR分析結果顯示,CCNE1 mRNA和蛋白水平在轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimics后的A2780細胞中較對照組均有明顯下調(diào)(1.00±0.077 vs 0.384±0.002)和(1.001±0.019vs0.62±0.019),在轉(zhuǎn)染 miR-424-5p inhibitor 后的Ho8910 細胞中較對照組明顯上調(diào)(1.001 ±0.057 vs 1.815±0.049)和(1.001±0.063 vs1.422±0.034),組間差異均具有統(tǒng)計學意義(**P0.01)。3.miR-424-5p與靶基因CCNE1作用位點分別位于247-254和485-492處,雙熒光素酶報告基因報告驗證結果顯示,在A2780細胞中miR-424-5p mimics+pGL-CCNE-1 3' UTR-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光信號強度明顯弱于NC對照組共轉(zhuǎn)染組,差異有顯著性(**p0.01)。在Ho8910細胞中miR-424-5p inhibitor+pGL-CCNE-1 3' UTR-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光信號強度明顯強于inhibitor NC對照組共轉(zhuǎn)染組,差異有顯著性(p0.01)。然而,對于突變型載體pGL-CCNE-13' UTR-MU,兩組熒光均沒有明顯區(qū)別(*p0.05)。4.免疫組化結果顯示,CCNE1在上皮性卵巢癌中及正常卵巢上皮中均有不同程度的表達,CCNE1主要分布于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi),呈棕黃色染色,在上皮性卵巢癌中強陽性表達,而在卵巢正常上皮細胞組織中低表達或不表達;qRt-PCR結果同樣顯示,CCNE1在上皮性卵巢癌組織中的相對表達水平(3.187 ± 0.1519)明顯高于正常卵巢上皮組織(1 ± 0.2219),差異顯著(**p0.01)。5.免疫組化評分中CCNE1評分越高,miR-424-5p水平越低,二者關系呈顯著負相關性(**p0.01)。qRT-PCR結果顯示,miR-424-5p低表達患者的CCNE1相對表達量越高,二者關系呈顯著負相關性(**p0.01)。研究結論及意義:1.在上皮性卵巢癌中,CCNE1是miR-424-5p的靶基因;2.miR-424-5p可通過調(diào)控CCNE1的3'-UTR區(qū)抑制CCNE1 mRNA和蛋白表達第三章miR-424-5p及其靶基因CCNE1對上皮性卵巢癌生物學的影響及調(diào)控機制的初步探索研究背景及目的:細胞的生長是通過細胞周期來實現(xiàn)的,外部環(huán)境及細胞內(nèi)癌基因激活及抑癌基因的失活都會觸發(fā)級聯(lián)式反應開啟細胞過度增殖。miRNA可作為癌基因和/或抑癌基因參與細胞周期的調(diào)控。在第二章中我們預測并鑒定miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的靶基因為CCNE1。CCNE1是細胞周期相關蛋白,在細胞周期中循環(huán)式表達,在細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換的過程中起到重要作用,由細胞周期調(diào)節(jié)蛋白E1基因編碼,然后與細胞蛋白依賴性激酶2(CDK2)形成復合物,促進細胞通過細胞周期G1/S期限制點,發(fā)揮調(diào)控真核細胞有絲分裂的作用。正常情況下,CCNE1在周期中有序進行表達核分裂,異常情況下,表達不穩(wěn)定可導致細胞周期失控,干擾細胞有絲分裂,導致染色體不穩(wěn)定,促進腫瘤生長。這一章,我們通過體外實驗來觀察miR-424-5p對卵巢癌生物學行為的影響,特別是細胞生長、周期及凋亡的影響,并且通過檢測下游通路上的相關蛋白來探索其在上皮性卵巢癌中的可能的作用機制。研究方法;1.用Western Blot檢測小干擾及過表達CCNE1質(zhì)粒的效果。2.在 A2780 細胞和 Ho8910 細胞中分別轉(zhuǎn)染 miR-424-5p mimics 和 miR-424-5p inhibitor來過表達或敲低miR-424-5p表達,利用CCK-8實驗繪制細胞生長曲線,通過對比各自的轉(zhuǎn)染對照NC組,了解miR-424-5p對細胞增殖的影響。si-CCNE1與miR-424-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染或CCNE1過表達質(zhì)粒與miR-424-5p mimics共轉(zhuǎn)染分別對A2780或Ho8910進行回復實驗觀察對細胞增殖的影響。3.利用流式細胞技術,觀察過表達或敲低miR-424-5p表達后對細胞周期和細胞凋亡的影響,并觀察細胞回復實驗了解CCNE1對miR-424-5p作用下的細胞周期的影響。4.Western Blot檢測CCNE1下游通路的E2F1和pRb蛋白表達水平。研究結果:1.Western Blot結果顯示,轉(zhuǎn)染小干擾CCNE1的Ho8910細胞,與si-NC對照組相比,CCNE1蛋白表達水平較對照組明顯下降,為0.022±0.0009倍,差異顯著(**p0.01);將CCNE1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A2780細胞內(nèi),與空載組相比,CCNE1蛋白表達水平較對照組明顯上升,1.428±0.2034倍,差異具有統(tǒng)計學意義(**p0.01)。2.CCK-8結果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimics的A2780細胞的48-96小時細胞存活率明顯下降,分別為0.5731 ±0.041vs 0.396±0.042,1.030±0.054vs0.626±0.052,1.453±0.045vs0.939±0.056;將 CCNE1過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入含有miR-424-5pmimics的A2780細胞,與空載質(zhì)粒組相比,細胞存活率上升,48小時OD值是0.308±0.025vs0.469±0.042,72小時 OD 值是 0.478±0.026vs0.744 ± 0.055,96 小時 OD 值是 0.739 ±0.046vs1.052±0.069。與 InhibitorNC 轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染 miR-424-5p inhibitor的Ho8910細胞的48-96小時細胞存活率明顯上升,分別為0.429±0.031vs 0.57±0.032,0.615±0.042vs0.842±0.043,1.020±0.041vs1.545±0.047。將小干擾CCNE1加入轉(zhuǎn)染的miR-424-5p inhibitor的Ho8910細胞系,與si-NC對照組比較(0.687±0.049,0.744±0.055,1.052±0.069.),細胞活力明顯下降,細胞生長變慢,48、72、96小時0D值分別是0.637±0.048,0.989±0.070,0.455±0.029,差異均具有統(tǒng)計學意義(*p0.05,**p0.01)。3.流式細胞技術結果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組(G0/G1期:57.32%±0.286%,S期:34.62%±0.563%)相比,轉(zhuǎn)染 miR-424-5p mimics 的 A2780 細胞的 G0/G1期比例明顯升高(72.883%±1.419%),S期明顯降低(24.873%±0.86%),差異具有統(tǒng)計學意義(*p0.05,**p0.01);而與轉(zhuǎn)染inhibitor NC相比(G0/G1 期:63.923%±0.309%,S 期:30.162%±0.57%),轉(zhuǎn)染 miR-424-5p inhibitor 的 Ho8910 細胞的 G0/G1 期比例明顯下降(55.23%± 1.367%),S期明顯上升(38.97%± 1.302%),差異均具有明顯統(tǒng)計學意義(*p0.05,**p0.01)�；貜蛯嶒灲Y果顯示共轉(zhuǎn)染CCNE1過表達質(zhì)粒后可抵抗miR-424-5p對G0/G1期的阻滯作用;干擾CCNE1表達后可以逆轉(zhuǎn)miR-424-5p抑制劑對細胞周期由G0/G1向S期的轉(zhuǎn)化。流式細胞技術結果顯示,分別在A2780或Ho8910細胞中上調(diào)或下調(diào)miR-424-5p的表達,對卵巢癌細胞的凋亡沒有顯著影響,差異沒有統(tǒng)計學意義(P = 0.1173,0.0596)。4.Western Blot檢測結果顯示,轉(zhuǎn)染miR-424-5p mimics的A2780細胞與對照組相比,E2F1 和 pRb 蛋白明顯下降(1.0 ± 0.047 vs 0.416 ± 0.013,1.0± 0.026 vs 0.81 ±0.039),回復實驗過表達CCNE1質(zhì)粒后可以逆轉(zhuǎn)E2F1和pRb蛋白的下調(diào)(0.416±0.013vs0.72±0.057,0.81±0.039vs1.147±0.032)。轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor的Ho8910細胞與對照組相比E2F1和pRb蛋白明顯上升(1.0±0.043vs 1.25±0.041,1.0±0.112vs 1.582±0.069),沉默CCNE1后會削弱對 E2F1 和 pRb 蛋白的上調(diào)(1.25±0.041 vs0.419±0.041,1.582±0.069 vs 0.866±0.112)。研究結論及意義:1.miR-424-5p抑制上皮性卵巢癌細胞增殖;2.CCNE1促進上皮性卵巢癌細胞增殖,過表達CCNE1后miR-424-5p抑制細胞增殖的作用被削弱。3.miR-424-5p通過靶向調(diào)節(jié)CCNE1/E2F1/pRb通路抑制上皮性卵巢癌的細胞增殖。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31
【圖文】：

Ｗ邋ｌ：；Ｍ逡逑蠢，？邋■邋■．垂■邋■‘邐■？痛．}0．灥■榦■逡逑圖１．２ｍｉＲ－４２４－５ｐ和Ｕ６熔解曲線逡逑Ｆｉｇｌ．２邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ邋和邋Ｕ６

＾ＳＣ…＇…逡逑Ｔ？４？邐＂？ａ逡逑圖１．１邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ和Ｕ６擴增曲線逡逑Ｆｉｇｌ．ｌ邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ邋和邋Ｕ６邋ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ逡逑ｍ？？邋ｃｕ？ｖ＊邐ｒ＜？０ｔｔ邋ｃｕ？ｖ？逡逑：｜邋Ｉ邋Ｉ邋＂邋＂邋］／＊邋１逡逑ｍｉＲ－４２４－５ｐ邋｜｜ｉ邐Ｕ６逡逑Ｈ邋１１邐１逡逑Ｗ邋ｌ：；Ｍ逡逑蠢，？邋■邋■．垂■邋■‘邐■？痛．}0．灥■榦■逡逑圖１．２ｍｉＲ－４２４－

邐ｎ＝２７邐ｎ＝ｌ２逡逑圖１．４邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ在不同上皮性卵巢癌中的相對表達情況（其中ｏｔｈｅｒ組包括８逡逑例粘液性癌，２例子宮內(nèi)膜樣癌，２例透明細胞癌）。ｍｉＲ－４２４－５ｐ相對表達含量逡逑在高級別漿液性癌較低級別漿液性癌明顯下降，二者差異具有統(tǒng)計學意義逡逑（＊＊ｐ＜０＿０１）．逡逑Ｆｉｇｌ．４邋Ｔｈｅ邋ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｄｉｆｆｅｒ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ＨＧＳＣ邋ａｎｄ逡逑ＬＧＳＣ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｓｕｂｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ＥＯＣ（＊＊ｐ＜０．０１）逡逑３８逡逑

【參考文獻】

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1 張爽爽;夏慶民;鄭榮壽;陳萬青;;中國2010年卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J];中國腫瘤;2016年03期

2 Hong Zheng;Jia-Yu Liu;Feng-Ju Song;Ke-Xin Chen;;Advances in circulating microRNAs as diagnostic and prognostic markers for ovarian cancer[J];Cancer Biology & Medicine;2013年03期

本文編號：2798593