【摘要】：【目的】宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性最常見的惡性腫瘤之一,其主要發(fā)生于發(fā)展中國家,死亡率較高。研究表明CC的發(fā)生發(fā)展主要與人乳頭瘤病毒(HPV)感染相關(guān)。與此同時,大量研究證明慢性非可控性炎癥的持續(xù)性存在可以在啟動、維持、促進腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。慢性非可控性炎癥不僅可以促進腫瘤發(fā)生,也可以參與腫瘤進展、免疫逃逸、血管生成和轉(zhuǎn)移過程。目前,炎癥引起惡性腫瘤發(fā)生的分子機制尚未完全清楚。眾所周知,微小RNA(micro RNA,mi RNA)主要在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,并影響疾病進展。為了探究mi RNA、炎癥和CC發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系,我們對經(jīng)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-Cd R)聯(lián)合處理以及未經(jīng)處理的He La細胞進行深度測序分析,從中選取了表達明顯升高的新mi RNA(命名為IC-N-mi R-20)進行后續(xù)研究。本研究目的在于探究IC-N-mi R-20對宮頸癌惡性行為的影響及其作用機制,以期為宮頸癌的發(fā)現(xiàn)、診斷以及治療提供新的思路�！痉椒ā渴紫�,我們根據(jù)深度測序結(jié)果選取了表達差異較大的10個mi RNA,并運用RT-q PCR對TNF-α和5-Aza-Cd R聯(lián)合處理后的He La細胞中mi RNA的表達情況進行驗證。接著,在He La細胞中瞬時轉(zhuǎn)染Dicer和Drosha敲降質(zhì)粒,通過RT-q PCR進一步驗證IC-N-mi R-20的形成是否依賴于經(jīng)典的mi RNA形成途徑。然后,應(yīng)用集落形成實驗、MTT實驗、Transwell遷移和侵襲實驗以及Western blot探究了IC-N-mi R-20對宮頸癌惡性行為及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程(EMT)的影響。之后,利用Target Scan Human 5.2 Custom預(yù)測IC-N-mi R-20的靶基因,使用EGFP熒光報告實驗驗證IC-N-mi R-20與靶基因之間的關(guān)系,并結(jié)合RT-q PCR和Western blot分別從m RNA水平和蛋白質(zhì)水平驗證IC-N-mi R-20對靶基因的調(diào)控作用。最后,利用細胞功能學(xué)實驗對靶基因的功能進行驗證;應(yīng)用挽救實驗驗證IC-N-mi R-20是否通過直接調(diào)控靶基因的表達發(fā)揮對宮頸癌細胞惡性行為的調(diào)控作用�！窘Y(jié)果】RT-q PCR結(jié)果表明TNF-α和5-Aza-Cd R聯(lián)合處理后IC-N-mi R-20表達升高,且其生成依賴于經(jīng)典的mi RNA生成途徑。細胞功能學(xué)實驗表明在He La和Si Ha細胞中過表達IC-N-mi R-20能夠促進其集落形成能力和遷移/侵襲能力,Western blot結(jié)果表明IC-N-mi R-20能夠下調(diào)E-cadherin的表達,上調(diào)Vimentin的表達,從而促進EMT進程,這意味著IC-N-mi R-20在宮頸癌中作為一個促癌基因發(fā)揮作用。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)IC-N-mi R-20在SOCS6 3’UTR具有潛在結(jié)合位點。EGFP熒光報告實驗結(jié)果確證了IC-N-mi R-20能夠直接靶定SOCS6,同時RT-q PCR和Western blot結(jié)果證明IC-N-mi R-20能夠從m RNA水平和蛋白質(zhì)水平負調(diào)控SOCS6的表達。而SOCS6對宮頸癌細胞集落形成能力、遷移/侵襲能力以及EMT進程起抑制作用,與IC-N-mi R-20的功能相反。最后,IC-N-mi R-20與靶基因的挽救實驗進一步驗證了IC-N-mi R-20促進宮頸癌細胞惡性行為是通過負調(diào)控靶基因SOCS6實現(xiàn)的。【結(jié)論】本實驗研究并證實了IC-N-mi R-20通過負調(diào)控SOCS6基因來促進宮頸癌細胞集落形成、遷移和侵襲,并且IC-N-mi R-20對SOCS6基因的負調(diào)控作用促進了宮頸癌EMT進程,最終從下游分子途徑解釋了IC-N-mi R-20調(diào)控宮頸癌細胞惡性行為的作用機制,同時也可能為宮頸癌的診斷和治療提供新的分子基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33
【圖文】：

圖 1-1 S01 和 S04 組 miRNA 差異表達火山圖的點表示每一個被檢測到的 miRNA，橫坐標(biāo)則表示該 miRNA 在兩樣品中表的對數(shù)值，橫坐標(biāo)絕對值越大，說明該 miRNA 在兩樣品間的表達量差異倍數(shù)越無處理組，S04 表示 TNF-α 和 5-Aza-CdR 聯(lián)合處理組。GO 和 KEGG 軟件分析呈差異性表達的 miRNA 靶基因的分布情況先我們對呈差異性表達的 miRNAs 的靶基因按照功能進行 GO 分類，分為與生物學(xué)過程，細胞組分和分子功能相關(guān)的三類，如圖 1-2A 所數(shù)據(jù)庫被用來分析這些靶基因分別存在于哪些已知通路中，并通過統(tǒng)計算這些基因的變化與哪些通路最為相關(guān)，結(jié)果顯示這些靶基因與物及腫瘤相關(guān)信號通路具有一定的相關(guān)性，如圖 1-2 B 所示。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文呈差異表達的 miRNA 靶基因進行 GO 分類分析 (A)，和 KEGG 分析 (B)。.2.3 RT-qPCR 驗證 miRNAs 的差異表達為了進一步確定 miRNAs 差異表達的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，我們按照上述制法重新制備了一批新的 RNA 樣品。同時，選取差異表達倍數(shù)較高的 10 iRNAs，使用 RT-qPCR 檢測這些 miRNAs 的表達情況。如圖 1-3 所示，新 miRNAnconservative_11_146640（將其命名為 IC-N-miR-20）的表達明顯升高，與深序結(jié)果一致，并且其表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文信息學(xué)軟件預(yù)測的 IC-N-miR-20 前體結(jié)構(gòu)和序列（A），以及C-N-miR-20 的形成過程iR-20 作為一個新的 miRNA，為了進一步驗證其生物胞里敲降 miRNA 生成過程中的兩個關(guān)鍵核酸酶-DroR 檢測 IC-N-miR-20 的表達情況。結(jié)果表明敲降 Dros 表達明顯減少（圖 1-5），證明 IC-N-miR-20 的形成途徑。

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3 劉析t

本文編號：2795849