【摘要】：引言子宮頸癌是世界范圍內(nèi)影響婦女健康的一種最常見婦科惡性腫瘤,雖然早期篩查和治療降低了宮頸癌的發(fā)病率和死亡率,但對(duì)于許多發(fā)展中國(guó)家,宮頸癌仍是威脅婦女生命的常見婦科疾病。Rad21基因是Cohesin的一個(gè)亞單位,其主要作用是保持姐妹染色單體的粘合與分離,調(diào)控其他基因轉(zhuǎn)錄,以及在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起作用等。已有很多研究表明Rad21基因在多種腫瘤中過(guò)表達(dá),我們前期研究發(fā)現(xiàn)Rad21在宮頸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度和mRNA表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織,Rad21基因位點(diǎn)多態(tài)性與漢族婦女宮頸癌的發(fā)生有關(guān),提示Rad21可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。本研究采用慢病毒感染宮頸癌細(xì)胞的方法,觀察降調(diào)Rad21表達(dá)后對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為及放療敏感性的影響,生物信息學(xué)工具分析Rad21在宮頸癌中的作用及可能的致癌機(jī)制,并運(yùn)用裸鼠宮頸癌模型觀察降調(diào)Rad21表達(dá)后對(duì)移植瘤的影響,探索Rad21基因促進(jìn)宮頸癌發(fā)生的可能機(jī)制。第一部分 干擾Rad21基因?qū)m頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為及放療敏感性的研究目的研究Rad21基因干擾后對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為及放療敏感性的影響。方法1.細(xì)胞免疫化學(xué)和Western Blot(蛋白印跡)方法檢測(cè)Rad21基因在宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。2.四個(gè)Rad21慢病毒干擾質(zhì)粒、一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝。3.慢病毒感染HeLa和Siha細(xì)胞及Puromycin篩選,FQ-PCR和Western Blot方法檢測(cè)四條Rad21 shRNA的干擾效率,選出干擾效率最好的慢病毒干擾質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.CCK-8法檢測(cè)Rad21 shRNA感染前后HeLa和Siha細(xì)胞增殖能力的變化。5.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察Rad21 shRNA感染前后HeLa和Siha細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Rad21shRNA感染前后HeLa和Siha細(xì)胞的凋亡能力和細(xì)胞周期的變化。7.集落形成(Colony)技術(shù)檢測(cè)HeLa和Siha細(xì)胞的存活率。觀察穩(wěn)定感染Rad21shRNA后HeLa和Siha細(xì)胞對(duì)γ射線敏感性的變化。結(jié)果1.Rad21在宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞中均有表達(dá),且HeLa較Siha細(xì)胞中Rad21蛋白表達(dá)水平稍高。2.四條慢病毒干擾質(zhì)粒除TL309968A外,其余均有干擾效果,HeLa細(xì)胞中TL309968B干擾效果最佳,Siha細(xì)胞中TL309968C干擾效果最佳,干擾效率均在60%以上。3.干擾Rad21基因表達(dá)后,抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,誘導(dǎo)凋亡,使細(xì)胞阻滯在G2/M期,增加放療的敏感性。小結(jié)1.Rad21在宮頸癌細(xì)胞系HeLa和Siha細(xì)胞中均有表達(dá)。2.Rad21參與了宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、周期、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為,說(shuō)明Rad21在宮頸癌的發(fā)生過(guò)程中有著重要作用,與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制密切相關(guān)。3.應(yīng)用慢病毒感染干擾Rad21基因表達(dá)后,增加了宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性,這對(duì)應(yīng)用慢病毒感染干擾Rad21基因表達(dá)治療子宮頸癌提供了理論依據(jù)。第二部分TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘Rad21基因在宮頸癌中的作用機(jī)制目的探討Rad21基因在宮頸癌中可能的致癌機(jī)制。方法1.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載306例宮頸癌患者的臨床數(shù)據(jù),根據(jù)患者Rad21基因表達(dá)水平分為高,中、低三組,進(jìn)行Kaplan Meier生存分析,探討Rad21基因與患者預(yù)后的關(guān)系。2.生物信息學(xué)工具分析Rad21基因在宮頸癌中的作用及表達(dá)相關(guān)基因,尋找Rad21基因可能的致癌機(jī)制。3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)和慢病毒感染下調(diào)宮頸癌HeLa細(xì)胞中Rad21基因的表達(dá),FQ-PCR和Western Blot方法檢測(cè)XPO1(核輸出蛋白1)、P53及細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果1.Rad21高表達(dá)組總生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組,隨著臨床期別增高,Rad21的表達(dá)逐漸升高,但無(wú)顯著性差異。2.GO(Gene ontology)結(jié)果顯示Rad21位于染色體著絲粒部位、核染色質(zhì)和cohesin復(fù)合體內(nèi),能夠與染色質(zhì)結(jié)合,具有DNA依賴性ATP酶活性,在DNA重組、雙鏈斷裂修復(fù)及有絲分裂姐妹染色單體聚合、分離中起作用。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)結(jié)果顯示宮頸癌中 Rad21 主要在細(xì)胞周期和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮作用。3.STRING(檢索基因/蛋白質(zhì)相互作用的檢索工具)結(jié)果顯示Rad21和XPO1之間存在蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。4.干擾Rad21表達(dá)后,XPO1、CyclinB1及CDK1的表達(dá)降低,而P21、P27及抑癌基因P53表達(dá)升高;反之,Rad21表達(dá)升高后,XPO1、CyclinB1和CDK1表達(dá)升高,而P21、P27及抑癌基因P53表達(dá)降低。小結(jié)1.Rad21高表達(dá)的患者存活時(shí)間比Rad21低表達(dá)的患者生存時(shí)間縮短。2.Rad21和XPO1的RNA核轉(zhuǎn)運(yùn)之間有著密切的功能關(guān)系。3.Rad21基因可能是通過(guò)參與細(xì)胞周期調(diào)控和XPO1對(duì)抑癌基因的核輸出而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。第三部分下調(diào)Rad21蛋白表達(dá)對(duì)子宮頸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及侵襲的作用目的探討下調(diào)Rad21蛋白對(duì)裸鼠宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)的作用,并進(jìn)一步研究其對(duì)抑制瘤增殖、凋亡的影響,為以Rad21基因?yàn)榘悬c(diǎn)的子宮頸癌治療提供新的依據(jù)。方法1.構(gòu)建人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。2.記錄裸鼠的生長(zhǎng)曲線及死亡狀況,于第30d脫頸椎處死裸鼠,剝離腫瘤,測(cè)量腫瘤的大小并取材拍照。3.免疫組化SP法檢測(cè)兩組裸鼠移植瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)的表達(dá)。4.TUNEL法檢測(cè)移植瘤組織細(xì)胞的凋亡。5.Western Blot方法檢測(cè)各組移植瘤組織中Rad21及相關(guān)基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果1.成功構(gòu)建移植瘤裸鼠模型,成瘤率100%。2.自接種后第9天起腫瘤體積Rad21干擾組裸鼠明顯小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且顯著性差異持續(xù)存在,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。3.免疫組化SP法檢測(cè)顯示,實(shí)驗(yàn)組移植瘤細(xì)胞中PCNA和VEGFR-2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TUNEL法檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,Rad21干擾組中細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.穩(wěn)定干擾Rad21表達(dá)后,XPO1、CyclinB1和CDK1蛋白表達(dá)降低,而P21、P27及抑癌基因P53蛋白表達(dá)升高。小結(jié)1.應(yīng)用HeLa細(xì)胞裸鼠皮下接種可成功構(gòu)建裸鼠宮頸癌移植瘤模型。2.干擾HeLa細(xì)胞中Rad21蛋白表達(dá)后,能夠抑制裸鼠宮頸癌移植瘤的生長(zhǎng),使移植瘤的增殖和新生血管生成降低,細(xì)胞的凋亡增加。3.Rad21基因可能通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控和XPO1的核輸出功能參與宮頸癌的發(fā)展。結(jié)論1.在宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞中,干擾Rad21基因抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,誘導(dǎo)凋亡,使細(xì)胞阻滯在G2/M期,對(duì)放療的敏感性增加。2.Rad21高表達(dá)的宮頸癌患者存活時(shí)間比Rad21低表達(dá)的患者生存時(shí)間縮短。3.干擾Rad21蛋白表達(dá)后,能夠抑制裸鼠宮頸癌移植瘤的生長(zhǎng),使移植瘤的增殖和新生血管生成降低,細(xì)胞的凋亡增加。4.Rad21和XPO1的RNA核轉(zhuǎn)運(yùn)之間有著密切的功能關(guān)系,Rad21基因可能通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控和XPO1對(duì)抑癌基因的核輸出而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

ａｄ２１ｍＲＮＡ和蛋白的表達(dá)，４條慢病毒干擾質(zhì)粒除ＴＬ３０９９６８Ａ外，其余均有干逡逑擾效果，ＨｅＬａ細(xì)胞中ＴＬ３０９９６８Ｂ干擾效果最佳，Ｓｉｈａ細(xì)胞中ＴＬ３０９９６８Ｃ干擾逡逑效果最佳，干擾效率在６０％以上。如圖１．３、圖１．４。篩選出的干擾質(zhì)粒用于后逡逑續(xù)的生物學(xué)行為研究。逡逑［＞？ｓｏｃ？ａｌｗｎ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑ａ邐Ｒｏ邋ｖｔＣｙｃ＾ｅ逡逑２１逡逑

Ｈｉ逡逑ＨｅＬａ邐Ｓｉｈａ逡逑圖１．２邋Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ在宮頸癌細(xì)胞系ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ中的感染效果。（Ｘ丨00）。逡逑４．４邋Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ慢病毒感染可下調(diào)ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ細(xì)胞中Ｒａｄ２１逡逑的表達(dá)逡逑利用慢病毒介導(dǎo)的ＲＮＡｉ技術(shù)，包裝含Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ和陰性對(duì)照的慢病毒逡逑顆粒，并用其感染ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ細(xì)胞，經(jīng)Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ篩選后構(gòu)建Ｒａｄ２１基因下逡逑調(diào)的細(xì)胞株。提取各組細(xì)胞總ＲＮＡ和蛋白，ＦＱ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測(cè)Ｒ逡逑ａｄ２１ｍＲＮＡ和蛋白的表達(dá)，４條慢病毒干擾質(zhì)粒除ＴＬ３０９９６８Ａ外，其余均有干逡逑擾效果，ＨｅＬａ細(xì)胞中ＴＬ３０９９６８Ｂ干擾效果最佳，Ｓｉｈａ細(xì)胞中ＴＬ３０９９６８Ｃ干擾逡逑效果最佳，干擾效率在６０％以上。如圖１．３、圖１．４。篩選出的干擾質(zhì)粒用于后逡逑續(xù)的生物學(xué)行為研究。逡逑［＞？ｓｏｃ？ａｌｗｎ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑ａ邐Ｒｏ邋ｖｔＣｙｃ＾ｅ逡逑２１逡逑

用ＣＣＫ－８法檢測(cè)干擾組Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ、陰性對(duì)照組Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ和空白逡逑組Ｃｏｎｔｒｏｌ細(xì)胞接種后第１－４天各組細(xì)胞的吸光度值（０Ｄ值）。見表１．４。以培養(yǎng)逡逑時(shí)間為橫坐標(biāo)，測(cè)得的０Ｄ值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。圖１．５。結(jié)果表明，逡逑Ｒａｄ２１干擾組的ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞增殖能力明顯下降（Ｐ＜０．０５），接逡逑種當(dāng)天和接種后第一天無(wú)明顯改變（Ｐ＞０．０５）。逡逑表丨．４邋Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ對(duì)ＨｅＬａ、Ｓｉｈａ干擾后各組細(xì)胞不同時(shí)間的光密度值（０Ｄ值NB義士＾）逡逑分組邐Ｏｈ邐２４ｈ邐４８ｈ邐７２ｈ邐９６ｈ邐尸值邐／Ｍ直逡逑ＨｅＬａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐０．１９４±０．０３０邐０．３９５±０．０１８邐０．６９５±０．０１３邐０．９２５±０．０７７邐Ｉ．０７４±０．０７０邐１６２．６０２邐＜０．００１逡逑Ｎｅｇａｔｉｖｅ邐０．１９０±０．０２９邐０．３７７±０．０２４邐０．６４１邋±０．０４３邐０．８８１±０．０５９邐１．０３２±０．０４０邐２１８．２０８邐＜０．００１逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ＴＬ３０９９６８Ｂ＊＊邐０．１８３±０．０２１邐０．３５４±０．０３６邐０．３９８±０．０３４邐０．５５９±０．０３８邐０．６３６±０．０２５邐９５．３２８邐＜０．００１逡逑廠值邐０．１２８邐１．６７５邐７０．６５３邐３３．００６邐７４．１７０逡逑尸值邐０．８８２邐０．２６４邐＜０．００１邐０．００１邐＜０．００１逡逑Ｓｉｈａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋０．１８８±０．０６０邋０．４５６±０．０９３邋０．６５４±０．０６１邐０．８９０±０．１００邐１

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1 程嬌;順鉑通過(guò)下調(diào)IL-17E/IL-17RB表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲[D];江南大學(xué);2018年

2 羅旋;油酸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的體內(nèi)外研究及機(jī)制探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

3 郭路路;葉酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞中miR-375及DNMT1表達(dá)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

4 陳穎;PRPS2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2018年

5 錢莉莉;子宮頸癌細(xì)胞中ΔNp63α的表達(dá)機(jī)制及Lnc-LIF-AS促進(jìn)LIF表達(dá)的分子機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

6 毛軼凡;MIR218靶向作用于APC抑制宮頸癌細(xì)胞行為的研究[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2018年

7 李正義;基于強(qiáng)特征CNN-SVM的宮頸癌細(xì)胞檢測(cè)[D];北京交通大學(xué);2018年

8 卞干霞;MiR-381-3p通過(guò)靶向FGF7抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[D];蘇州大學(xué);2018年

9 張劍;宮頸癌細(xì)胞中miR-130a-TNF-a-NF-κB通路的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

10 王艷麗;宮頸癌細(xì)胞中miR-181b通過(guò)靶定AC9參與由NF-κB調(diào)控的正反饋環(huán)路[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2794464