【摘要】：目的c-Jun是轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1(activator protein 1,AP-1)的重要組成部分,在調(diào)控腫瘤的分化發(fā)育以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的過(guò)程中起重要作用。研究表明細(xì)胞內(nèi)c-Jun蛋白很不穩(wěn)定,極易發(fā)生泛素化/蛋白酶依賴的蛋白降解。目前已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)c-Jun蛋白的泛素連接酶,這些泛素連接酶通過(guò)泛素化c-Jun蛋白,下調(diào)了c-Jun的蛋白水平,從而調(diào)控c-Jun介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路。然而與泛素連接酶相對(duì)應(yīng)的去泛素化酶在調(diào)控c-Jun蛋白及其功能的研究鮮有報(bào)道。為了回答這一科學(xué)問(wèn)題,本研究將通過(guò)構(gòu)建去泛素化酶基因表達(dá)庫(kù),并利用該表達(dá)庫(kù)篩選調(diào)控c-Jun蛋白水平的去泛素化酶,初步探討所篩選的的去泛素化酶對(duì)c-Jun下游信號(hào)通路及其c-Jun依賴的腫瘤細(xì)胞侵襲行為的影響。方法(1)利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建去泛素化酶基因表達(dá)庫(kù),運(yùn)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染將去泛素化酶基因表達(dá)庫(kù)中的所有質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞提取蛋白,通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)去泛素化酶表達(dá)水平。(2)運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將去泛素化酶基因表達(dá)庫(kù)中的所有質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞提取蛋白,通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后c-Jun蛋白的表達(dá)水平。(3)利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行體外去泛素化測(cè)定,檢測(cè)USP6是否可在體外直接去泛素化c-Jun。(4)構(gòu)建c-Jun敲低的穩(wěn)定細(xì)胞系,運(yùn)用AP-1報(bào)告基因熒光素酶活性檢測(cè)分析敲低c-Jun對(duì)USP6誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。(5)運(yùn)用Realtime-PCR檢測(cè)MMP10基因的表達(dá)水平,分析USP6對(duì)c-Jun下游基因MMP10的調(diào)節(jié)作用。(6)利用Transwell法檢測(cè)USP6對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果(1)初步構(gòu)建了去泛素化酶基因(共68個(gè))表達(dá)庫(kù),利用去泛素化酶表達(dá)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)USP6可調(diào)節(jié)c-Jun蛋白的水平。(2)在體外泛素化實(shí)驗(yàn)中,野生型USP6能直接去泛素化c-Jun,而酶活性突變體USP6不能直接將c-Jun去泛素化。(3)敲低c-Jun可下調(diào)USP6對(duì)AP-1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因活性的影響。(4)敲低USP6后可下調(diào)Hela細(xì)胞MMP10基因的表達(dá),并且敲低c-Jun后可阻斷USP6對(duì)MMP10表達(dá)的誘導(dǎo)作用。(5)過(guò)表達(dá)USP6能顯著增強(qiáng)Hela細(xì)胞的侵襲能力,敲低USP6能抑制Hela細(xì)胞的侵襲能力;敲減c-Jun后過(guò)表達(dá)USP6不能增強(qiáng)Hela細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)論去泛素化酶USP6通過(guò)去泛素化作用,穩(wěn)定c-Jun蛋白水平,提高AP-1活性,促進(jìn)MMP10的轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)Hela細(xì)胞的侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

圖 2.4.2 USP6突變體構(gòu)建方法2.2.1.3 USP6、c-Jun RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)所使用的干擾載體為 pLV-H1-EF1a-puro，載體圖譜如下圖所示

素化基因表達(dá)庫(kù)：將所有的去泛素化酶表達(dá)質(zhì)粒，利用磷酸鈣48h收集細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)去泛素化酶的表達(dá)情素化酶表達(dá)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn) USP6 調(diào)節(jié) c-Jun 蛋白有調(diào)節(jié) c-Jun蛋白水平的相關(guān)的去泛素化酶，我們對(duì)建立達(dá)庫(kù)進(jìn)行了篩選。我們將所有的去泛素化酶表達(dá)質(zhì)粒利胞，48h 后提取細(xì)胞總蛋白，利用 Western -Blot 檢測(cè) c- USP6質(zhì)粒的 Hela 細(xì)胞，c-Jun 的蛋白表達(dá)水平增高，見(jiàn)

立去泛素化基因表達(dá)庫(kù)：將所有的去泛素化酶表達(dá)質(zhì)粒，利用磷酸鈣轉(zhuǎn)3T細(xì)胞，48h收集細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)去泛素化酶的表達(dá)情況。用去泛素化酶表達(dá)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn) USP6 調(diào)節(jié) c-Jun 蛋白水篩選具有調(diào)節(jié) c-Jun蛋白水平的相關(guān)的去泛素化酶，我們對(duì)建立的基因表達(dá)庫(kù)進(jìn)行了篩選。我們將所有的去泛素化酶表達(dá)質(zhì)粒利用脂 Hela 細(xì)胞，48h 后提取細(xì)胞總蛋白，利用 Western -Blot 檢測(cè) c-Jun。轉(zhuǎn)染 USP6質(zhì)粒的 Hela 細(xì)胞，c-Jun 的蛋白表達(dá)水平增高，見(jiàn)圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2792759