【摘要】：第一部分中國(guó)漢族卵巢早衰相關(guān)因素分析背景：卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是以女性40歲以前原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng),不孕,促性腺激素升高(FSH40IU/L)、雌激素降低及生殖器官萎縮等圍絕經(jīng)期表現(xiàn)為特征的內(nèi)分泌疾病。女性過(guò)早閉經(jīng)(40歲)可導(dǎo)致卵巢激素水平急劇下降并出現(xiàn)嚴(yán)重的圍絕經(jīng)期癥狀,患者的生理、心理均受到嚴(yán)重的影響。目前已明確部分POF病因,包括基因和染色體異常、自身免疫性因素、病毒感染、環(huán)境和醫(yī)源性因素(如盆腔手術(shù)和放、化療病史)等,但大部分POF患者病因仍不清楚。POF病因的復(fù)雜性和異質(zhì)性增加了早期診斷和預(yù)防的難度。POF確診時(shí)卵巢功能多已發(fā)生不可逆性損傷,因而如何早期預(yù)測(cè)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及早做出診斷尤為重要。研究目的：本研究選取大樣本中國(guó)漢族POF患者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查,從社會(huì)學(xué)特征、既往病史、環(huán)境因素及生活習(xí)慣四個(gè)方面探討POF發(fā)病的相關(guān)因素,以期發(fā)現(xiàn)POF的危險(xiǎn)因素,預(yù)測(cè)POF的高危人群,做到早預(yù)防、早診斷和早治療。研究方法：募集2008年～2013年就診于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院的553例POF患者和400例對(duì)照組女性,對(duì)其進(jìn)行一對(duì)一專人問(wèn)卷調(diào)查。對(duì)參與者的社會(huì)學(xué)特征、月經(jīng)史、生育史、既往病史、環(huán)境因素和生活習(xí)慣等進(jìn)行單因素和多因素Logistic回歸分析,計(jì)算OR值(odds ratios, OR)、95%可信區(qū)間(95%confidence intervals,95% CI)和P值。結(jié)果：553例POF患者中,65例(65/544,11.95%)為原發(fā)性閉經(jīng),479例(479/544,88.05%)為繼發(fā)性閉經(jīng)�；旧鐣�(huì)學(xué)特征(職業(yè)、學(xué)歷等)未發(fā)現(xiàn)與POF的發(fā)病有相關(guān)性(P0.05)。環(huán)境因素方面,居住和/或工作環(huán)境裝修、經(jīng)常接觸農(nóng)藥和化學(xué)試劑等有毒物質(zhì)的女性更易患POF,較對(duì)照組具有顯著性差異(OR= 4.76 [2.98-7.61]; OR= 11.56 [5.51-24.25]; OR= 4.47 [2.09-9.58]).對(duì)既往病史進(jìn)行單因素Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn),流行性腮腺炎病史、陽(yáng)性家族史和盆腔手術(shù)史,包括卵巢囊腫剝除術(shù)(子宮內(nèi)膜異位囊腫、漿液性囊腫和畸胎瘤)、一側(cè)卵巢切除術(shù)和輸卵管異位妊娠手術(shù)(輸卵管開窗術(shù)、輸卵管端端吻合術(shù)和輸卵管切除術(shù))可顯著增加POF的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.26 [2.38-4.47]; OR= 28.12 [8.84-89.46]; OR= 5.53 [2.15-14.23])。日常生活中經(jīng)常飲茶、喜好素食和飲用礦物質(zhì)水的女性患POF的風(fēng)險(xiǎn)較低(OR= 0.04 [0.03-0.07]; OR= 0.27 [0.19-0.37]; OR= 0.63 [0.47-0.85])。結(jié)論：遺傳因素、盆腔手術(shù)史、流行性腮腺炎病史和有毒物質(zhì)接觸史為POF的危險(xiǎn)因素,而多食用素食、飲用礦物質(zhì)水和茶葉為保護(hù)性因素。我們建議有POF易感風(fēng)險(xiǎn)的女性及早進(jìn)行遺傳咨詢,遠(yuǎn)離可引起內(nèi)分泌紊亂的危險(xiǎn)因素,適量進(jìn)食富含類黃酮的食物,如水果、蔬菜和茶葉等。第二部分腫瘤抑制因子WT1基因變異在卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中的作用研究背景：卵巢早衰(POF)是具有遺傳異質(zhì)性的內(nèi)分泌疾病,目前已明確遺傳因素是POF的一個(gè)重要病因,但是大部分患者的病因尚不清楚。WT1基因(Wilms' tumors gene, WT1)是調(diào)控哺乳動(dòng)物尿生殖嵴發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中,WT1的表達(dá)量隨卵泡的發(fā)育而逐漸減少,推測(cè)WT1基因可能通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞分化調(diào)控卵泡發(fā)育。條件性敲除小鼠Wt1+/R394W由于卵泡發(fā)育障礙而表現(xiàn)為不孕不育,其表型與POF的臨床表現(xiàn)相似。以上發(fā)現(xiàn)提示W(wǎng)T1基因可能通過(guò)影響顆粒細(xì)胞發(fā)育而在卵泡發(fā)生(folliculogenesis)中起著重要的作用,因而可視作POF的重要候選基因。研究目的：本研究通過(guò)對(duì)384例中國(guó)漢族POF患者的WT1基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)基因變異,并就新發(fā)變異進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和體外功能實(shí)驗(yàn),以探討WT1基因變異在POF發(fā)病機(jī)制中的作用。研究方法：共納入2003年4月～2011年12月于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院就診的384例中國(guó)漢族POF患者為研究對(duì)象,募集查體中心卵巢功能正常的384例健康女性作為對(duì)照。采用直接測(cè)序技術(shù)對(duì)WT1基因編碼區(qū)進(jìn)行突變篩查,應(yīng)用在線軟件Mutation Taster Polyphen-2和SIFT對(duì)新發(fā)錯(cuò)義突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。通過(guò)序列比對(duì),在小鼠野生型Wtl表達(dá)載體上進(jìn)行定點(diǎn)誘變,將野生型和突變型Wt1表達(dá)載體均進(jìn)行腺病毒包裝、擴(kuò)增和純化。野生型和突變型Wt1腺病毒分組感染3周齡小鼠的黃素化顆粒細(xì)胞,使Wtl基因過(guò)表達(dá),通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Wtl下游基因Amh、Fshr、Lhr、Cyp19、Cdh1和Par6b的表達(dá)量,以明確WT1基因新發(fā)突變對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。結(jié)果：通過(guò)對(duì)384例POF患者WT1基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)新發(fā)突變和10個(gè)已知單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。新發(fā)突變包括2個(gè)錯(cuò)義突變(位于第1外顯子的c.376CT, p. Pro126Ser和位于第7外顯子的C.1109GA, p. Arg370His)和4個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)的突變(分別為位于第1內(nèi)含子的c.647-26CT, c.647-13GC,c.647-13GA和位于第4內(nèi)含子的c.950+14TC)。10個(gè)已知SNPs有8個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)(rs2234585、 rs1799933、rs5030170、rs5030171、rs2295081、rs5030277、rsl92734605和rs1799937),2個(gè)位于編碼區(qū)但沒(méi)有改變編碼氨基酸(c.330TC,rs1799925和C.1107GA, rs16754)。通過(guò)功能預(yù)測(cè)提示p. Pro126Ser和p. Arg370His可能影響蛋白功能,具有致病性。進(jìn)一步體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wt1基因上調(diào)下游基因Amh、Cdh1和Par6b的表達(dá),而下調(diào)Fshr、Lhr和Cyp19基因的表達(dá)。錯(cuò)義突變p. Pro126Ser和p. Arg370His均可抑制下游基因Amh和Cdhl的表達(dá),促進(jìn)Fshr和Cyp19的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論：受WT1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因AMH, FSHR和CYP19參與顆粒細(xì)胞分化,CDH1影響卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞相互作用。在中國(guó)漢族POF患者中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)新發(fā)錯(cuò)義突變p. Pro126Ser和p. Arg370His均影響WT1對(duì)以上基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,導(dǎo)致顆粒細(xì)胞分化和卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞相互作用障礙,繼而引起卵泡的過(guò)早耗竭。推測(cè)WT1可能是POF的潛在致病基因。第三部分減數(shù)分裂重組因子DMC1基因與卵巢早-衰發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究背景：DMC1基因(DNA meiotic recombinase 1, DMC1)是減數(shù)分裂特異性基因,在減數(shù)分裂同源重組過(guò)程中起著重要作用。DMC1參與聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成和雙鏈DNA斷裂的修復(fù)。Dmcl敲除小鼠的卵母細(xì)胞無(wú)法形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體,停滯于減數(shù)分裂I期,卵泡數(shù)目急劇減少,類似人非綜合征型POF的臨床表現(xiàn),提示DMC1基因可作為POF的候選基因。研究目的：本研究對(duì)192例中國(guó)漢族POF患者進(jìn)行基因測(cè)序分析,探討DMC1基因與POF發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。研究方法：共納入192例就診于山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院的中國(guó)漢族POF患者。采用直接測(cè)序技術(shù)對(duì)DMC1基因外顯子區(qū)進(jìn)行基因突變篩查。將單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的基因型頻率和等位基因頻率同國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)公布的亞洲正常人群數(shù)據(jù)相比較,研究SNPs與中國(guó)漢族POF發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)2個(gè)已知SNPs,分別是位于第4內(nèi)含子的rs11570392和位于第10內(nèi)含子的rs4987164。這兩個(gè)SNPs的基因型和等位基因頻率在中國(guó)漢族POF患者和亞洲正常人群中均無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：在中國(guó)漢族POF人群中,DMC1基因編碼區(qū)變異并不常見。DMCl基因與POF發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性有待在大樣本不同種族的POF患者中做進(jìn)一步研究。第四部分脫氫表雄酮改善卵巢反應(yīng)不良患者輔助生殖周期中的卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局背景：人類輔助生殖(assisted reproduction technique, ART)周期的妊娠率和活產(chǎn)率與卵巢儲(chǔ)備密切相關(guān),獲卵數(shù)和卵子質(zhì)量是影響妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素。卵巢反應(yīng)不良(poor ovarian response, POR)患者較卵巢功能正常女性在ART周期中獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均有所減少,導(dǎo)致妊娠率降低。雄激素參與卵泡發(fā)育成熟過(guò)程,雄激素過(guò)低是影響卵子質(zhì)量的重要因素之一。脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)主要來(lái)源于腎上腺皮質(zhì),是類固醇激素合成的重要前體物質(zhì),隨著年齡的增加而逐漸減少,在女性生殖周期中起著重要作用。近年來(lái),DHEA已經(jīng)用于POR患者超促排卵前的預(yù)處理,但尚缺乏大樣本的研究和長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)。研究目的：探討DHEA對(duì)中國(guó)漢族POR患者在ART周期中的卵巢反應(yīng)性及妊娠結(jié)局的影響。研究方法：回顧性分析2012年1月～2014年12月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院接受體外受精-移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)和胞漿內(nèi)單精子注射-移植(intra cytoplasmic sperm injection and embryo transfer, ICIS-ET)的POR患者170例�；颊叻肈HEA 25mg, bid,服藥2-4個(gè)月后再次IVF/ICSI-ET助孕,前后兩周期給予同一控制性超促排卵方案,對(duì)患者ART周期中卵巢反應(yīng)性相關(guān)指標(biāo)和妊娠結(jié)局進(jìn)行自身對(duì)照研究。采用配對(duì)t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)對(duì)患者服藥前后卵巢基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(antral follicle count. AFC)、HCG日優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)(直徑14mm)、血清E2、P和LH水平、獲卵數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、妊娠率及流產(chǎn)率進(jìn)行比較。結(jié)果：170例患者平均年齡36歲,其中原發(fā)性不孕85例,繼發(fā)性不孕85例,睪酮均25ng/dl。服用DHEA后HCG日14mm以上上卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚數(shù)[5.59+4.09,6.42+5.33,3(1-5),1(0-3)]較服藥前[4.87+3.15,5.74+4.29,2(1-4),0(0-2)]均有顯著改善,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)治療后臨床妊娠率[29(17.06%)]顯著高于治療前[1(0.59%)],生化妊娠流產(chǎn)率[6(3.53%)]顯著低于治療前[12(7.06%)](P0.01)�；A(chǔ)竇卵泡數(shù)和HCG日血清E2、P和LH水平服用DHEA前后無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：DHEA預(yù)處理可以增加POR患者獲卵數(shù),改善卵子及胚胎質(zhì)量,提高臨床妊娠率,降低生化妊娠流產(chǎn)率。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R711.75

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