發(fā)布時間：2020-08-12 15:17

【摘要】：第一部分中國漢族卵巢早衰相關因素分析背景：卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是以女性40歲以前原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng),不孕,促性腺激素升高(FSH40IU/L)、雌激素降低及生殖器官萎縮等圍絕經(jīng)期表現(xiàn)為特征的內(nèi)分泌疾病。女性過早閉經(jīng)(40歲)可導致卵巢激素水平急劇下降并出現(xiàn)嚴重的圍絕經(jīng)期癥狀,患者的生理、心理均受到嚴重的影響。目前已明確部分POF病因,包括基因和染色體異常、自身免疫性因素、病毒感染、環(huán)境和醫(yī)源性因素(如盆腔手術和放、化療病史)等,但大部分POF患者病因仍不清楚。POF病因的復雜性和異質(zhì)性增加了早期診斷和預防的難度。POF確診時卵巢功能多已發(fā)生不可逆性損傷,因而如何早期預測發(fā)生風險及早做出診斷尤為重要。研究目的：本研究選取大樣本中國漢族POF患者進行問卷調(diào)查,從社會學特征、既往病史、環(huán)境因素及生活習慣四個方面探討POF發(fā)病的相關因素,以期發(fā)現(xiàn)POF的危險因素,預測POF的高危人群,做到早預防、早診斷和早治療。研究方法：募集2008年～2013年就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的553例POF患者和400例對照組女性,對其進行一對一專人問卷調(diào)查。對參與者的社會學特征、月經(jīng)史、生育史、既往病史、環(huán)境因素和生活習慣等進行單因素和多因素Logistic回歸分析,計算OR值(odds ratios, OR)、95%可信區(qū)間(95%confidence intervals,95% CI)和P值。結果：553例POF患者中,65例(65/544,11.95%)為原發(fā)性閉經(jīng),479例(479/544,88.05%)為繼發(fā)性閉經(jīng)�；旧鐣䦟W特征(職業(yè)、學歷等)未發(fā)現(xiàn)與POF的發(fā)病有相關性(P0.05)。環(huán)境因素方面,居住和/或工作環(huán)境裝修、經(jīng)常接觸農(nóng)藥和化學試劑等有毒物質(zhì)的女性更易患POF,較對照組具有顯著性差異(OR= 4.76 [2.98-7.61]; OR= 11.56 [5.51-24.25]; OR= 4.47 [2.09-9.58]).對既往病史進行單因素Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn),流行性腮腺炎病史、陽性家族史和盆腔手術史,包括卵巢囊腫剝除術(子宮內(nèi)膜異位囊腫、漿液性囊腫和畸胎瘤)、一側(cè)卵巢切除術和輸卵管異位妊娠手術(輸卵管開窗術、輸卵管端端吻合術和輸卵管切除術)可顯著增加POF的患病風險(OR=3.26 [2.38-4.47]; OR= 28.12 [8.84-89.46]; OR= 5.53 [2.15-14.23])。日常生活中經(jīng)常飲茶、喜好素食和飲用礦物質(zhì)水的女性患POF的風險較低(OR= 0.04 [0.03-0.07]; OR= 0.27 [0.19-0.37]; OR= 0.63 [0.47-0.85])。結論：遺傳因素、盆腔手術史、流行性腮腺炎病史和有毒物質(zhì)接觸史為POF的危險因素,而多食用素食、飲用礦物質(zhì)水和茶葉為保護性因素。我們建議有POF易感風險的女性及早進行遺傳咨詢,遠離可引起內(nèi)分泌紊亂的危險因素,適量進食富含類黃酮的食物,如水果、蔬菜和茶葉等。第二部分腫瘤抑制因子WT1基因變異在卵巢早衰發(fā)病機制中的作用研究背景：卵巢早衰(POF)是具有遺傳異質(zhì)性的內(nèi)分泌疾病,目前已明確遺傳因素是POF的一個重要病因,但是大部分患者的病因尚不清楚。WT1基因(Wilms' tumors gene, WT1)是調(diào)控哺乳動物尿生殖嵴發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。在大鼠卵巢顆粒細胞中,WT1的表達量隨卵泡的發(fā)育而逐漸減少,推測WT1基因可能通過抑制顆粒細胞分化調(diào)控卵泡發(fā)育。條件性敲除小鼠Wt1+/R394W由于卵泡發(fā)育障礙而表現(xiàn)為不孕不育,其表型與POF的臨床表現(xiàn)相似。以上發(fā)現(xiàn)提示W(wǎng)T1基因可能通過影響顆粒細胞發(fā)育而在卵泡發(fā)生(folliculogenesis)中起著重要的作用,因而可視作POF的重要候選基因。研究目的：本研究通過對384例中國漢族POF患者的WT1基因編碼區(qū)進行測序分析,發(fā)現(xiàn)基因變異,并就新發(fā)變異進行功能預測和體外功能實驗,以探討WT1基因變異在POF發(fā)病機制中的作用。研究方法：共納入2003年4月～2011年12月于山東大學附屬生殖醫(yī)院就診的384例中國漢族POF患者為研究對象,募集查體中心卵巢功能正常的384例健康女性作為對照。采用直接測序技術對WT1基因編碼區(qū)進行突變篩查,應用在線軟件Mutation Taster Polyphen-2和SIFT對新發(fā)錯義突變進行功能預測。通過序列比對,在小鼠野生型Wtl表達載體上進行定點誘變,將野生型和突變型Wt1表達載體均進行腺病毒包裝、擴增和純化。野生型和突變型Wt1腺病毒分組感染3周齡小鼠的黃素化顆粒細胞,使Wtl基因過表達,通過實時定量PCR檢測Wtl下游基因Amh、Fshr、Lhr、Cyp19、Cdh1和Par6b的表達量,以明確WT1基因新發(fā)突變對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。結果：通過對384例POF患者WT1基因編碼區(qū)進行測序分析發(fā)現(xiàn)6個新發(fā)突變和10個已知單核苷酸多態(tài)位點(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。新發(fā)突變包括2個錯義突變(位于第1外顯子的c.376CT, p. Pro126Ser和位于第7外顯子的C.1109GA, p. Arg370His)和4個位于內(nèi)含子區(qū)的突變(分別為位于第1內(nèi)含子的c.647-26CT, c.647-13GC,c.647-13GA和位于第4內(nèi)含子的c.950+14TC)。10個已知SNPs有8個位于內(nèi)含子區(qū)(rs2234585、 rs1799933、rs5030170、rs5030171、rs2295081、rs5030277、rsl92734605和rs1799937),2個位于編碼區(qū)但沒有改變編碼氨基酸(c.330TC,rs1799925和C.1107GA, rs16754)。通過功能預測提示p. Pro126Ser和p. Arg370His可能影響蛋白功能,具有致病性。進一步體外功能實驗發(fā)現(xiàn)Wt1基因上調(diào)下游基因Amh、Cdh1和Par6b的表達,而下調(diào)Fshr、Lhr和Cyp19基因的表達。錯義突變p. Pro126Ser和p. Arg370His均可抑制下游基因Amh和Cdhl的表達,促進Fshr和Cyp19的表達(P0.05)。結論：受WT1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因AMH, FSHR和CYP19參與顆粒細胞分化,CDH1影響卵母細胞-顆粒細胞相互作用。在中國漢族POF患者中發(fā)現(xiàn)的兩個新發(fā)錯義突變p. Pro126Ser和p. Arg370His均影響WT1對以上基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,導致顆粒細胞分化和卵母細胞-顆粒細胞相互作用障礙,繼而引起卵泡的過早耗竭。推測WT1可能是POF的潛在致病基因。第三部分減數(shù)分裂重組因子DMC1基因與卵巢早-衰發(fā)病機制的相關性研究背景：DMC1基因(DNA meiotic recombinase 1, DMC1)是減數(shù)分裂特異性基因,在減數(shù)分裂同源重組過程中起著重要作用。DMC1參與聯(lián)會復合體的形成和雙鏈DNA斷裂的修復。Dmcl敲除小鼠的卵母細胞無法形成聯(lián)會復合體,停滯于減數(shù)分裂I期,卵泡數(shù)目急劇減少,類似人非綜合征型POF的臨床表現(xiàn),提示DMC1基因可作為POF的候選基因。研究目的：本研究對192例中國漢族POF患者進行基因測序分析,探討DMC1基因與POF發(fā)病機制的相關性。研究方法：共納入192例就診于山東大學附屬生殖醫(yī)院的中國漢族POF患者。采用直接測序技術對DMC1基因外顯子區(qū)進行基因突變篩查。將單核苷酸多態(tài)位點(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的基因型頻率和等位基因頻率同國際人類基因組單體型圖計劃數(shù)據(jù)庫公布的亞洲正常人群數(shù)據(jù)相比較,研究SNPs與中國漢族POF發(fā)病的相關性。結果：共發(fā)現(xiàn)2個已知SNPs,分別是位于第4內(nèi)含子的rs11570392和位于第10內(nèi)含子的rs4987164。這兩個SNPs的基因型和等位基因頻率在中國漢族POF患者和亞洲正常人群中均無顯著性差異(P0.05)。結論：在中國漢族POF人群中,DMC1基因編碼區(qū)變異并不常見。DMCl基因與POF發(fā)病機制的相關性有待在大樣本不同種族的POF患者中做進一步研究。第四部分脫氫表雄酮改善卵巢反應不良患者輔助生殖周期中的卵巢反應性及妊娠結局背景：人類輔助生殖(assisted reproduction technique, ART)周期的妊娠率和活產(chǎn)率與卵巢儲備密切相關,獲卵數(shù)和卵子質(zhì)量是影響妊娠結局的關鍵因素。卵巢反應不良(poor ovarian response, POR)患者較卵巢功能正常女性在ART周期中獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均有所減少,導致妊娠率降低。雄激素參與卵泡發(fā)育成熟過程,雄激素過低是影響卵子質(zhì)量的重要因素之一。脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)主要來源于腎上腺皮質(zhì),是類固醇激素合成的重要前體物質(zhì),隨著年齡的增加而逐漸減少,在女性生殖周期中起著重要作用。近年來,DHEA已經(jīng)用于POR患者超促排卵前的預處理,但尚缺乏大樣本的研究和長期隨訪數(shù)據(jù)。研究目的：探討DHEA對中國漢族POR患者在ART周期中的卵巢反應性及妊娠結局的影響。研究方法：回顧性分析2012年1月～2014年12月在山東大學附屬生殖醫(yī)院接受體外受精-移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)和胞漿內(nèi)單精子注射-移植(intra cytoplasmic sperm injection and embryo transfer, ICIS-ET)的POR患者170例�；颊叻肈HEA 25mg, bid,服藥2-4個月后再次IVF/ICSI-ET助孕,前后兩周期給予同一控制性超促排卵方案,對患者ART周期中卵巢反應性相關指標和妊娠結局進行自身對照研究。采用配對t檢驗、非參數(shù)檢驗和卡方檢驗對患者服藥前后卵巢基礎竇卵泡數(shù)(antral follicle count. AFC)、HCG日優(yōu)勢卵泡數(shù)(直徑14mm)、血清E2、P和LH水平、獲卵數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、妊娠率及流產(chǎn)率進行比較。結果：170例患者平均年齡36歲,其中原發(fā)性不孕85例,繼發(fā)性不孕85例,睪酮均25ng/dl。服用DHEA后HCG日14mm以上上卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚數(shù)[5.59+4.09,6.42+5.33,3(1-5),1(0-3)]較服藥前[4.87+3.15,5.74+4.29,2(1-4),0(0-2)]均有顯著改善,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。經(jīng)卡方檢驗發(fā)現(xiàn)治療后臨床妊娠率[29(17.06%)]顯著高于治療前[1(0.59%)],生化妊娠流產(chǎn)率[6(3.53%)]顯著低于治療前[12(7.06%)](P0.01)�；A竇卵泡數(shù)和HCG日血清E2、P和LH水平服用DHEA前后無顯著性差異(P0.05)。結論：DHEA預處理可以增加POR患者獲卵數(shù),改善卵子及胚胎質(zhì)量,提高臨床妊娠率,降低生化妊娠流產(chǎn)率。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R711.75

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4 沈R

本文編號：2790697