【摘要】：宮內(nèi)生長受限(intrauterine growth restriction,IUGR)或胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)指的是胎兒生長速率低于正常胎兒生長潛力的一種病理狀態(tài)。目前尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),臨床上通常以小于胎齡兒(smallforgestationalage infants,SGA)的定義,即“出生體重低于同胎齡同性別胎兒的平均出生體重的第十百分位數(shù)或兩個標(biāo)準(zhǔn)差”作為診斷依據(jù)。IUGR是死產(chǎn)的主要危險因素,顯著增加圍產(chǎn)期的發(fā)病率和死亡率。大量的流行病學(xué)證據(jù)已證實,IUGR與成年期心血管疾病(cardiovasculardiseases,CVDs)的風(fēng)險增加密切相關(guān);已有研究表明,IUGR個體成年期CVDs風(fēng)險的增加與生命早期血管功能和結(jié)構(gòu)的改變有關(guān),主要表現(xiàn)為血壓升高、血管舒張功能受損以及主動脈內(nèi)膜增厚等。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn),IUGR大鼠在成年期經(jīng)歷低氧后發(fā)生肺動脈高壓、肺血管重構(gòu)的風(fēng)險顯著增加,與肺血管內(nèi)皮功能改變有關(guān)。鑒于血管內(nèi)皮在維持血管張力和結(jié)構(gòu)中的重要作用,上述的血壓升高、血管重塑以及血管舒張功能受損實際上反映了血管內(nèi)皮功能失調(diào)。然而,這種與IUGR有關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)的具體分子機(jī)制尚不清楚。血管內(nèi)皮功能失調(diào)以內(nèi)皮依賴的血管舒張功能受損為特征,與許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一氧化氮(nitric oxide,NO)生物利用度降低是血管內(nèi)皮功能失調(diào)的關(guān)鍵。NO是一種血管舒張因子,主要由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)通過 L-精氨酸(L-arginine)/NO 通路所合成,對維持血管張力和內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。L-arginine/NO通路還受到精氨酸酶(arginase)的調(diào)控,L-arginine可以被arginase轉(zhuǎn)化為鳥氨酸(ornithine)和尿素(urea),過多的arginase通過競爭底物L(fēng)-arginine導(dǎo)致eNOS解聚、NO合成減少,引起血管功能失調(diào)。此外,非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一種內(nèi)源性的NOS抑制劑,通過影響NO的生成引起血管功能失調(diào)。血循環(huán)中的ADMA可作為評估心血管風(fēng)險的標(biāo)志物。內(nèi)源性的ADMA是由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(proteinargininemethyltransferase,PRMT)催化合成的,主要通過二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)進(jìn)行代謝。內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)是一種強(qiáng)效的血管收縮因子。血管內(nèi)皮產(chǎn)生的ET-1作用于平滑肌細(xì)胞的內(nèi)皮素A型受體(endothelin receptor type-A,ETAR)和 B 型受體(endothelinreceptortype-B,ETBR)從而引起血管收縮;而ET-1與內(nèi)皮細(xì)胞上分布的ETBR結(jié)合,則可促進(jìn)NO的釋放和ET-1的清除,進(jìn)而調(diào)節(jié)血管舒縮。血管內(nèi)皮ET-1基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 α,HIF-1α)的調(diào)控。我們前期研究發(fā)現(xiàn),在 IUGR 新生大鼠的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中,HIF-1α在ET-1基因啟動子區(qū)富集,導(dǎo)致ET-1表達(dá)增加,與成年期肺血管對低氧的敏感性升高密切相關(guān)。越來越多的研究表明,L-arginine/NO通路在IUGR相關(guān)的血管功能失調(diào)中具有重要作用,然而arginase、ADMA和ET-1通路是否參與了 IUGR的血管內(nèi)皮功能的調(diào)控有待進(jìn)一步的研究�；谝陨险撌�,我們提出假設(shè):(1)IUGR影響血管內(nèi)皮功能相關(guān)的基因表達(dá),從而引起血管功能失調(diào);(2)arginase、ADMA和ET-1通路參與了 IUGR相關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)。本研究通過收集IUGR和正常新生兒的臍帶組織,分離培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),評估其增殖能力,分析與血管張力調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激以及血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況,從而研究IUGR對血管內(nèi)皮功能的影響;通過分析血管內(nèi)皮NO的生成、ADMA代謝、arginase的活性和表達(dá),以及ET-1系統(tǒng)的表達(dá)情況,研究arginase、ADMA和ET-1通路在IUGR的血管內(nèi)皮功能調(diào)控中的作用,從而進(jìn)一步探究IUGR相關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)的潛在分子機(jī)制。第一部分宮內(nèi)生長受限對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響目的:1.了解宮內(nèi)生長受限(IUGR)新生兒及產(chǎn)婦的臨床特征。2.通過分離培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),建立IUGR組和Control組的血管內(nèi)皮細(xì)胞系。3.通過評估HUVECs的增殖能力,分析血管功能相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,研究IUGR對血管內(nèi)皮功能的影響。方法:1.臨床資料的收集:從三家醫(yī)院產(chǎn)科收集新生兒及產(chǎn)婦的病歷資料。排除多胎、先天畸形、感染、孕期用藥等,根據(jù)胎兒生長曲線,以出生體重在第十百分位數(shù)以下的新生兒為IUGR組;以出生體重在第十百分位數(shù)至第九十百分位數(shù)之間的新生兒為對照(Control)組。整理分析收集的新生兒及產(chǎn)婦的臨床資料。2.原代HUVECs的分離培養(yǎng)及鑒定:用膠原酶消化法從新鮮臍帶組織中分離培養(yǎng)原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用免疫熒光法進(jìn)行鑒定,傳代培養(yǎng)。3.細(xì)胞增殖能力的評估:用CCK-8法檢測HUVECs的增殖情況。4.分析血管功能相關(guān)基因的表達(dá)譜:實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法檢測并分析與調(diào)節(jié)血管張力、氧化應(yīng)激、血管生成的基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:1.共納入IUGR組和對照組各15例。新生兒及產(chǎn)婦的臨床特征顯示:IUGR組新生兒的出生體重(P=0.002)和體重指數(shù)(P= 0.002)顯著低于對照組。IUGR組新生兒的出生體重均在第5百分位數(shù)以下,中位數(shù)位于第3百分位數(shù)。與對照組相比,IUGR組更容易出現(xiàn)胎兒狀態(tài)不良或胎兒窘迫(P=0.025)。2.分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞于顯微鏡下表現(xiàn)為典型的血管內(nèi)皮細(xì)胞外觀:呈多角形或梭形,大小均勻,核大且清晰,胞漿豐富,細(xì)胞匯合時呈緊密排列的單層鵝卵石鑲嵌狀。3.免疫熒光鑒定結(jié)果顯示:內(nèi)皮特異性抗原血小板內(nèi)皮黏附分子1(CD31)和血管假性血友病因子(vWF)陽性的細(xì)胞均占95%以上。4.CCK-8細(xì)胞增殖曲線顯示:IUGR組的HUVECs在培養(yǎng)96h時檢測的增殖速率顯著高于對照組(P= 0.003)。5.RT-qPCR結(jié)果顯示,IUGR的HUVECs中促進(jìn)血管收縮的EDN1(P = 0.018)、ARG2(P = 0.007)基因表達(dá)增加,調(diào)節(jié)血管舒張的NOS3(P = 0.035)、EDNRB(P = 0.023)、AGTR1(P0.001)基因表達(dá)減少;參與氧化應(yīng)激的HIF1A(P= 0.008)基因上調(diào),抗氧化的SOD1(P=0.005)基因下調(diào);促血管生成的ANG(P0.001)基因上調(diào),抗血管生成的AKAP12(P0.001)基因下調(diào)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建IUGR組和Control組的血管內(nèi)皮細(xì)胞系。2.IUGR促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。3.IUGR的血管內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)血管收縮和舒張、氧化應(yīng)激和抗氧化、血管生成和抗血管生成的基因表達(dá)失衡,提示血管內(nèi)皮功能失調(diào)。第二部分宮內(nèi)生長受限相關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)的機(jī)制研究目的:1.驗證血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO生物利用度降低,以及eNOS和Arg-2的表達(dá)失衡在IUGR相關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)中的重要作用。2.研究血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性NOS抑制劑ADMA,以及ADMA合成與分解代謝所需的酶PRMT和DDAH是否參與了 IUGR相關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)。3.探究血管內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控血管收縮的ET-1和ETBR,以及轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α在IUGR相關(guān)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)中的作用。方法:1.通過Griess比色分析法檢測HUVECs中NO的代謝物亞硝酸鹽和硝酸鹽總量,以測定NO的生成量。2.通過Arginase活性試劑盒檢測arginase的活性。3.用100μM的氯化鈷(CoCl2)對HUVECs處理24h,以模擬低氧條件。4.用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法測定HUVECs中L-arginine和ADMA的水平。5.通過免疫熒光法分析HUVECs中的ET-1、ETBR的空間定位情況。6.通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和免疫印跡(western blot)檢測HUVECs中 eNOS、arginase-2、PRMT1、DDAH1、DDAH2、ET-1、ETBR 和 HIF-1α 的表達(dá)水平。結(jié)果:1.與對照組相比,IUGR組HUVECs中NO生成減少(P = 0.002),同時eNOS表達(dá)減少(P=0.021),而精氨酸酶活性(P = 0.012)和Arg-2表達(dá)(P= 0.009)水平均升高。2.與對照組相比,IUGR組的HUVECs內(nèi)ADMA水平(P=0.001)和ADMA/L-arginine比值(P=0.046)均升高,同時DDAH1蛋白表達(dá)顯著減少(P = 0.010)。3.在低氧條件下,對照組HUVECs中ADMA水平較正常氧濃度時升高(P=0.042);與對照組相比,IUGR組ADMA/L-arginine比值明顯升高(P=0.003),同時PRMT1表達(dá)顯著增加(P=0.006)。4.HUVECs中的ET-1和ETBR的空間分布具有相關(guān)性。IUGR組ET-1(P= 0.004)和HIF-1α(P=0.007)表達(dá)增加,而ETBR的表達(dá)減少(P= 0.027)。在低氧條件下,IUGR組HIF-1α表達(dá)水平仍高于對照組(P= 0.027)。結(jié)論:1.IUGR的血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS和Arg-2表達(dá)失衡,導(dǎo)致NO合成減少、生物利用度降低,引起血管功能失調(diào)。2.IUGR的血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH1表達(dá)減少,ADMA分解代謝減少,導(dǎo)致ADMA積聚,NO合成減少,引起血管功能失調(diào)。3.在低氧條件下,IUGR的血管內(nèi)皮細(xì)胞中PRMT1表達(dá)增加,ADMA合成代謝增加,導(dǎo)致L-arginine生物學(xué)利用度降低,從而引起血管功能失調(diào)。4.IUGR的血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)增加,促進(jìn)ET-1的轉(zhuǎn)錄,同時ETBR表達(dá)減少,導(dǎo)致NO釋放減少,引起血管功能失調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.51
【圖文】：

圖２．１細(xì)胞總ＲＮＡ提取操作流程圖逡逑２．２．７逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)逡逑按照ＴａＫａＲａ的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ說明書將提取的ＲＮＡ逆轉(zhuǎn)錄成逡逑ｃＤＮＡ

逑（５邋；）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算出樣品中一氧化氮的濃度。逡逑（６）標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見圖２．１，供參考。逡逑０．６邋ｎ邐逡逑０．４邋邐逡逑１逡逑0－２逡逑０邐ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０逡逑ＮａＮ0２（ｊｉｍｏｌ／Ｌ）逡逑圖２．１亞硝酸鈉（ＮａＮ０２）的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑４２逡逑

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐正文第二部分材料與方法逡逑（２）試劑的準(zhǔn)備：逡逑１）使用前將所需試劑及樣品緩慢均衡至室溫（１８？２５邋°Ｃ），其余酶標(biāo)條及試逡逑劑按指定條件保存。逡逑２）標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液０．５邋ｍＬ，蓋好后室溫靜逡逑置大約１０分鐘，同時輕輕搖動（避免起泡），其濃度為１０００邋ｎｇ／ｍＬ。準(zhǔn)備逡逑５個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的ＥＰ管，每個ＥＰ管中加入６００邋ｐＬ的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖逡逑２．２邋所示依次三倍稀釋成邋１０００邋ｎｇ／ｍＬ、３３３．３３邋ｎｇ／ｍＬ、１１１．１１邋ｎｇ／ｍＬ、３７．０４逡逑ｎｇ／ｍＬ、１２．３５邋ｎｇ／ｍＬ，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（Ｏｎｇ／ｍＬ）直接作為空白孔。逡逑３００ｐＬ邋３０0ｍＬ邋３００ｐＬ邐３００｜ｊＬ逡逑

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4 鄭煦f

本文編號：2790508