發(fā)布時間：2020-08-12 03:21

【摘要】：研究背景和意義子宮頸癌(cervical cancer)是常見的女性惡性腫瘤,其全球發(fā)病率僅次于乳腺癌,近年來子宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢,嚴重威脅女性的健康和生命�，F(xiàn)有的預防治療手段中,宮頸癌的疫苗已經上市可以進行早期預防,手術切除、放療和輔助化療等治療方式也取得了巨大的進步。然而有很多患者被發(fā)現(xiàn)時已經處于中、晚期,原本有效的治療方法變得效果不佳或無效。因此,迫切需要探索一種有效的腫瘤標志物用于早期診斷及改進治療策略。腫瘤壞死因子α誘導蛋白8(TNFAIP8或TIPE)是最近發(fā)現(xiàn)的一種癌基因,也被稱做GG2-1,SCC-S2,MDC-3.13。TIPE在多種癌癥中高表達,并且參與了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,抑制了腫瘤細胞的凋亡以及降低了腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。有研究表明,在女性腫瘤中,TIPE高表達于子宮內膜癌,并且在子宮內膜癌的發(fā)展中TIPE還與基質金屬蛋白酶-9及增殖性抗原Ki-67的表達高度相關。在卵巢癌中,TIPE與腫瘤的臨床病理特征和預后有一定相關性,但其在子宮頸癌中的表達和參與調節(jié)子宮頸細胞的生長、侵襲及遷移的機制尚未確定。所以研究TIPE對子宮頸癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響及確切的機制,發(fā)現(xiàn)和找出一個新的干預靶點,對子宮頸癌的治療和改善病人預后有著重要的意義。研究目的探討TIPE對子宮頸癌細胞的增殖、浸潤、轉移及凋亡的影響及相關機制,為子宮頸癌的早期臨床診斷和靶向治療提供依據(jù)。研究方法運用免疫組化技術測定臨床病例的癌組織和癌旁組織中TIPE的表達量,分析TIPE在癌組織和癌旁組織中的表達差異。敲除HeLa、C-33A、SiHa三種子宮頸癌細胞中的TIPE基因,通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細胞株。運用MTS實驗技術檢測TIPE對子宮頸癌細胞增殖能力的影響;通過劃痕實驗與Transwell實驗分析TIPE對子宮頸癌細胞遷移能力的影響;用Matrigel實驗分析TIPE對子宮頸癌細胞侵襲能力的影響;通過TUNEL實驗和流式細胞術檢測TIPE對子宮頸癌細胞凋亡能力的影響;Western Blot檢測TNFR1受體信號通路中相關凋亡蛋白的表達。建立荷瘤小鼠模型,分析敲低TIPE對子宮頸癌細胞在裸鼠體內成瘤的影響。結果免疫組化測定結果顯示,子宮頸的癌旁組織中TIPE表達水平低于癌組織。敲低子宮頸癌HeLa、C-33A、SiHa細胞系中TIPE的表達,MTS結果顯示敲低組細胞增殖能力顯著低于對照組細胞;從劃痕、Transwell、Matrigel的實驗結果以及結合相關侵襲蛋白MMP2、MMP9的檢測水平,可以看出敲低TIPE能夠明顯降低子宮頸癌細胞HeLa、C-33A、SiHa的遷移、侵襲能力;TUNEL實驗和流式檢測結果顯示,敲除TIPE的子宮頸癌細胞的抗凋亡能力低于對照組細胞。此外,Western Blot結果顯示,TNFR1通路中調控凋亡的相關蛋白如FADD、casepase3、casepase9、p-JNK、Bax等蛋白表達增加;SiHa細胞在裸鼠皮下成瘤顯示敲低TNFAIP8降低了裸鼠瘤體的生長速度和瘤體的大小。結論腫瘤壞死因子α誘導的蛋白8(TIPE)促進子宮頸癌細胞的增殖、浸潤轉移,抑制其凋亡。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33
【圖文】：

圖 3-1 標準曲線曲線，計算每個樣品的蛋白濃度。交法驗證敲低 TIPE品：根據(jù)測得濃度，構建所需體系：向蛋白樣加入 5×S，使所有蛋白樣品終濃度都一致并且使 Loading Buffer 水中煮 10-15min，置于冰上備用或于-20℃。：根據(jù)需要制聚丙烯酰胺凝膠，選擇合適濃度的膠（注水封，避免氣泡），插梳子備用。膠凝后，按順序加入蛋白er 用 1×Loading Buffer 按量補齊。調 80V，電泳 30 min，再 150V，電泳約 120 min（具體去濃縮凝膠，溴酚藍及不用部分的膠，剩余所需部分置于

4 結 果4 結果4.1 TIPE 在子宮頸癌組織中的表達高于癌旁組織免疫組化技術檢測 40 例癌及癌旁組織子宮頸癌中 TIPE 的表達量。結果顯示，我們發(fā)現(xiàn)癌與癌旁組織均有不同程度的 TIPE 表達，癌組織的表達高于癌旁（圖 1A）；將組織中的 TIPE 的表達量按陰性、低表達、表達、高表達分別分為 4 個等級，即 0、1、23。不同病人組織的 TIPE 表達量不同（圖 1B）。

圖 2.RT-PCR 和 Western blot 檢測子宮頸癌敲低組和對照組細胞中 TIPE 的表達。4.3 敲低 TIPE 降低子宮頸癌細胞的增殖能力MTS 實驗結果顯示，敲低 TIPE 在 SiHa,HeLa 和 C-33A 細胞中的表達后，敲低組細胞增殖能力明顯降低，尤其以 SiHa 和 HeLa 細胞較為明顯。SiHa 細胞的對照組 NegshRNA 從第三天開始增殖較敲低組明顯，結果有顯著差異（p＜0.05）；HeLa 細胞的對照組 Neg shRNA48 小時以后增殖較 TNFAIP8 shRNA 明顯，p＜0.05，結果有顯著差異；而 C-33A 細胞的對照組 Neg shRNA 和敲低組 TNFAIP8 shRNA 之間的差異不太顯著，在第一天到第四天幾乎沒有差異，到第五天對照組才比敲低組增殖生長快（圖 3）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 劉珍;張蔚;胡曉霞;藍嬌;肖瑞平;陳璐璐;王琳琳;;microRNA-218對宮頸癌細胞增殖和遷移的影響[J];中華腫瘤防治雜志;2015年20期

2 ;Role of JNK activation in apoptosis:Adouble-edged sword[J];Cell Research;2005年01期

本文編號：2789973