【摘要】：第一部分 體外受精出生小鼠心肌組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達(dá)的變化目的:評(píng)估體外受精(IVF)出生小鼠從幼年到老年的心肌組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)各基因及其心血管效應(yīng)基因表達(dá)變化。材料及方法:1.利用C57BL/6J小鼠建立IVF及體內(nèi)受精小鼠(in vivo)模型。出生小鼠飼養(yǎng)至3周,10周及1.5年時(shí),分別給予安樂(lè)死獲取兩組小鼠的心臟組織。2.TRIZOL法抽提小鼠心肌組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,通過(guò)熒光定量PCR技術(shù),測(cè)定兩組中RAS系統(tǒng)基因Ren1,Ren2,Ace,Ace2,Agt,Agtr1a,Agtr1b,Agtr2,及其心血管效應(yīng)基因Col1a1,Col1a2,Col3 and Ctgf的mRNA相對(duì)表達(dá)量。3.用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取心肌組織的蛋白質(zhì),采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,Western blot技術(shù)檢測(cè)AGTR1,AGTR2,CTGF and COL3蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:1.在3周齡時(shí),IVF組的Ren1,Ace,Agtr1a,Col3和Ctgf的mRNA表達(dá)水平顯著高于體內(nèi)組。同樣,在10周齡時(shí),IVF組中的Ace,Agt,Agtrlb,Agtr2,Col1al和Col3的mRNA表達(dá)水平也明顯高于體內(nèi)組。當(dāng)達(dá)到1.5歲時(shí),IVF組Ren1,Ace,Agtr1b,Col3和Ctgf的mRNA表達(dá)水平仍然高于體內(nèi)組。2.在3周齡時(shí),IVF組AGTR1和CTGF的蛋白表達(dá)水平與體內(nèi)組相比顯著增加。10周齡時(shí)兩組中AGTR1,AGTR2和CTGF蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在老年時(shí),IVF組AGTR1蛋白表達(dá)明顯上調(diào),但其余蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異。結(jié)論:IVF出生小鼠幼崽期,心肌組織中RAS系統(tǒng)部分基因及其心血管發(fā)育和功能調(diào)節(jié)相關(guān)效應(yīng)基因的表達(dá)水平升高,且這種改變可以持續(xù)存在,直到老年階段,提示ART過(guò)程可影響出生小鼠心肌組織RAS系統(tǒng)基因表達(dá),并可能是IVF后代心血管畸形或功能障礙的潛在危險(xiǎn)因素之一。第二部分 體外受精出生小鼠心肌組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達(dá)改變機(jī)制研究目的:研究IVF出生小鼠心肌組織中RAS改變的調(diào)控機(jī)制,闡明IVF作用因素可能影響子代成年后心血管的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié),探究基因相互作用機(jī)制,為降低IVF出生子代的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)研究提供思路和途徑。材料及方法:1.使用DNeasy血液和組織試劑盒提取兩組小鼠心肌組織中的基因組DNA。對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾,并使用靶向捕獲測(cè)序技術(shù),檢測(cè)Col1l1,Ctgf以及印記基因的啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化情況。2.提取小鼠心肌組織中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后,通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)老年時(shí)期兩組小鼠中的miRNA表達(dá)譜。3.在芯片篩出的差異miRNA中,聚焦在miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)后分別與Col3a1,Agtr1a和Col1a2相互作用的miRNA:miR-100,miR-297和miR-758作為檢測(cè)目標(biāo)。通過(guò)定量PCR技術(shù),驗(yàn)證miR-100,miR-297,and miR-758在兩組中的表達(dá)情況。4.通過(guò)構(gòu)建分別帶有AGTR1 3'-UTR或AGTR1 3'-UTR突變片段并將其插入pmiR-RB-Report的熒光素酶報(bào)告基因載體,分別轉(zhuǎn)染miR-297a-3pmimic或陰性對(duì)照(NC)到293T細(xì)胞,檢測(cè)AGTR1與miR-297的相互作用情況。5.培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染microRNA mimic,在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-297。6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí),用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取心肌細(xì)胞中的蛋白質(zhì),采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,Western blot技術(shù)檢測(cè)AGTR1,CTGF和COL3蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。7.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí),向培養(yǎng)物中加入5-乙炔基-20-脫氧尿苷(EdU)(10μM),并使細(xì)胞再生長(zhǎng)2小時(shí)。分別使用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡觀察H9c2心肌細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:1.與體內(nèi)組相比,IVF組3周時(shí)Ctgf的平均DNA甲基化水平顯著下降。10周時(shí)Ctgf的CpG位點(diǎn)18和Ctgf在老年時(shí)期的CpG位點(diǎn)2和14的甲基化水平在IVF組中顯著降低。2.在3周齡時(shí),Col1a1的CpG位點(diǎn)4的甲基化水平在IVF組中顯著降低。Col1a1在10周時(shí)的CpG位點(diǎn)6和8以及Col1a1在老年時(shí)期的CpG位點(diǎn)1,2和3的甲基化水平在IVF組中顯著降低。3.在3周齡時(shí),兩組之間未發(fā)現(xiàn)miR-100,miR-297和miR-758的表達(dá)水平顯著改變。而在第10周,miR-100和在IVF組中觀察到miR-758與體內(nèi)組相比顯著升高。在老年時(shí)期也有類似的趨勢(shì),發(fā)現(xiàn)IVF組miR-100,miR-297和miR-758的表達(dá)水平顯著增加。4.miR-297a-3p模擬物顯著調(diào)節(jié)pmiR-AGTR1-WT載體的螢光素酶活性。然而,pmiR-AGTR1-Mut載體的熒光素酶活性不受miR-297a-3p模擬物的影響。這些結(jié)果表明miR-297a-3p直接靶向AGTR1并調(diào)節(jié)其表達(dá)。5.miR-297過(guò)表達(dá)48 h,后AGTR1和CTGF蛋白表達(dá)明顯增加,表明miR-297可與AGTR1相互作用,進(jìn)一步促進(jìn)CTGF蛋白的表達(dá)。6.與對(duì)照組相比,miR-297過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。7.IVF組的Igf2r在1.5年時(shí)的平均DNA甲基化水平顯著降低;IVF組的Mest在10周時(shí)的平均DNA甲基化水平有明顯升高;IVF組的Snrpn在3周齡時(shí)的平均DNA甲基化水平顯著降低。結(jié)論:1.IVF出生小鼠心肌細(xì)胞Ctgf和Col1a1基因表達(dá)水平升高可能是由于其Ctgf和Col1a1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平降低所致。2.miR-100,miR-297和miR-758可能參與了 IVF出生小鼠心肌細(xì)胞COL3,AGTR1和COL1表達(dá)的調(diào)控,且miR-297表達(dá)水平改變可能調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖活性。3.IVF可能通過(guò)改變表觀遺傳學(xué)的調(diào)控,導(dǎo)致的IVF出生小鼠RAS表達(dá)改變,該機(jī)制可能是IVF后代心血管畸形或功能障礙的潛在危險(xiǎn)因素。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714
【圖文】：

第？部分引言逡逑其調(diào)節(jié)功能改變的傾向［９］，諸如血管收縮壓升高、空腹血糖值上升一類成年性心逡逑血管疾病易感因素也已見(jiàn)報(bào)道（圖１．１）。而ＡＲＴ小鼠模型不僅顯示其出生子代存逡逑在血管內(nèi)皮調(diào)節(jié)功能和血脂代謝能力的改變［１０，邋１１］，而且顯示相關(guān)的改變與部分逡逑基因的甲基化修飾改變和表達(dá)異常有關(guān)。逡逑１９％年Ｂａｒｋｅｒ等提出“成年疾病的胎兒起源學(xué)說(shuō)”，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為成年后的心血管逡逑疾病及糖尿病等一些相關(guān)疾病來(lái)源于胎兒發(fā)育過(guò)程中，是機(jī)體對(duì)體外環(huán)境不良刺逡逑激的適應(yīng)性反應(yīng)［１２］�，F(xiàn)代ＡＲＴ技術(shù)通過(guò)藥物刺激實(shí)現(xiàn)多個(gè)卵子同步成熟，利用體逡逑外培養(yǎng)和顯微操作完成精卵細(xì)胞受精結(jié)合以及早期胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，其在消除患逡逑者生殖障礙病因的同時(shí)，涉及了生殖細(xì)胞增殖、受精、發(fā)育乃至分化的多個(gè)自然逡逑過(guò)程，存在導(dǎo)致配子、受精卵和胚胎發(fā)生不良應(yīng)激的可能性［１３］。受精及胚胎時(shí)期，逡逑特別是著床前胚胎

漿中血管緊張素原（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ，邋Ａｇｔ）水解轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ｉ邋（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋Ｉ，逡逑Ａｎｇｌ），然后，通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，邋ＡＣＥ）將逡逑其水解成Ａｎｇｌｌ－ＩＸ邋（圖１．２），使心率加快，血管收縮，心臟輸出量增加；加上繼逡逑發(fā)醛固酮釋放，腎小血管血流減少和鈉離子重吸收，水鈉潴留，進(jìn)而增加血容量，逡逑維持或升高血壓，完成機(jī)體的應(yīng)急反應(yīng)［１５］。另一方面，在血管壁、心臟等組織也逡逑有廣泛活躍的腎素－血管緊張素原合成和分泌，它們以旁分泌和（或）自分泌方式逡逑調(diào)節(jié)維護(hù)心血管的功能和結(jié)構(gòu)［１６］。全身或局部的多種刺激可通過(guò)局部的Ｒｅｎ釋放，逡逑激活心血管系統(tǒng)的ＲＡＳ系統(tǒng)，導(dǎo)致局部以Ａｎｇｌｌ為主的血管緊張素水平的升高釋逡逑放，后者與血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞內(nèi)具七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的Ｇ蛋白偶聯(lián)血管緊張素受逡逑體１型受體（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋ｔｙｐｅ邋１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ，邋ＡＴ邋１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結(jié)合并活化，調(diào)節(jié)心血管逡逑細(xì)胞的基因表達(dá)和功能［１７］。既往研究表明

達(dá)水平逡逑使用定量ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)ＲＡＳ組分中的基因及其相應(yīng)的效應(yīng)基因的表達(dá)水平，逡逑以研究ＩＶＦ對(duì)子代心肌中與心血管系統(tǒng)健康相關(guān)基因表達(dá)的影響（圖３．１）。在該逡逑研究中檢測(cè)的ＲＡＳ組分中的基因包括Ｚｃｅ２，邋NB鞏和＾／ｒ２。逡逑ＲＡＳ的相應(yīng)效應(yīng)基因包括Ｃｏ／ｋｉ，邐Ｃｏ／３和Ｃｆｇ／；在３周齡時(shí)，ＩＶＦ組中逡逑ｊｃｅ，邋Ｊｇｒｒ／ａ，邋和Ｃ／ｇ／＂的ｍＲＮＡ表達(dá)水平與體內(nèi)組相比顯著增加（１．１４倍，Ｐ逡逑＜０．０５；邋２．１５邋倍，Ｐ〈分別為邋０．０５；邋２．０１邋倍，尸邋＜０．０５；邋１．６２邋倍，Ｐ邋＜０．０５；和邋２．１３邋倍，Ｐ邋＜０．０５邋）逡逑（圖邋３．１Ａ）。Ｃｏ／／ａｉ邋和邋Ｃ＜？／７ａ２邋在邋ＩＶＦ邋組和體內(nèi)組之間的逡逑ｍＲＮＡ表達(dá)水平?jīng)]有觀察到顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（尸＞０．０５）（圖３．１Ａ）。在１０周逡逑齡時(shí)，與體內(nèi)組相比，ＩＶＦ組中Ｊｃｅ，邋ｄ�。茫铮椋妫欤停茫铮车模恚遥危铃义媳磉_(dá)水平也顯著增加（１．７４倍，尸＜０．０５；邋２．０４倍，尸＜０．０５；邋１．７９倍，尸＜０．０５；邋２．０８逡逑倍

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本文編號(hào)：2779082