【摘要】：背景:血漿游離DNA(circulating cell free DNA,ccfDNA)是細(xì)胞外游離存在于血液中的短片段DNA,主要來源于凋亡或壞死的細(xì)胞。健康人ccfDNA的含量較低,腫瘤患者體內(nèi)由腫瘤細(xì)胞釋放游離DNA可直接反映患者的分子信息,并使體內(nèi)ccfDNA含量相應(yīng)增加,對腫瘤的診斷具有重要意義。目的:探索血漿游離DNA含量及甲基化在上皮性卵巢癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法:收集2016年4月至2017年1月上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院收治的上皮性卵巢癌患者術(shù)前外周血和健康女性外周血。使用Qiagen QIAamp循環(huán)游離DNA試劑盒提取入組人群的血漿游離DNA,采用Qubit 3.0熒光計(jì)定量血漿游離DNA濃度,完成ccfDNA提取。隨后對樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽處理、文庫構(gòu)建、目標(biāo)區(qū)域富集、上機(jī)測序。t檢驗(yàn)評估ccfDNA濃度在EOC患者和健康人中的差異,Pearson檢驗(yàn)、Spearman檢驗(yàn)進(jìn)行ccfDNA與臨床特征相關(guān)性分析。Wilcoxon Rank Sum檢驗(yàn)篩選EOC患者與對照組ctDNA差異甲基化位點(diǎn),構(gòu)建差異甲基化位點(diǎn)的聯(lián)合診斷模型。Wilcoxon Rank Sum檢驗(yàn)篩選早期和晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移EOC患者ctDNA差異的甲基化位點(diǎn)。結(jié)果:(1)上皮性卵巢癌患者ccfDNA濃度顯著高于健康女性(P0.001),ROC曲線下面積為0.755(P0.001)。(2)上皮性卵巢癌患者ccfDNA濃度與腫瘤體積的對數(shù)呈正相關(guān)(r=0.78,P0.001),但與患者年齡、病理類型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、單雙側(cè)、CA125水平及Ki67表達(dá)量無顯著相關(guān)性(P0.05)。(3)上皮性卵巢癌患者ccfDNA存在128個(gè)差異甲基化位點(diǎn)(P0.05);128個(gè)差異甲基化位點(diǎn)的聯(lián)合診斷模型曲線下面積平均為91.7%;模型穩(wěn)健性分析曲線下面積平均為98%(P0.05)。(4)早期EOC患者與晚期EOC患者ccfDNA存在7個(gè)差異甲基化位點(diǎn);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移EOC患者ccfDNA存在21個(gè)差異甲基化位點(diǎn)(P0.05)。結(jié)論:血漿游離DNA濃度有助于上皮性卵巢癌的診斷,并可間接反映卵巢癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷;上皮性卵巢癌患者ctDNA差異甲基化位點(diǎn)有助于EOC的診斷,并對其分期、腫瘤轉(zhuǎn)移等臨床狀態(tài)的評估具有一定的參考價(jià)值。提示ccfDNA有望成為上皮性卵巢癌診斷及臨床監(jiān)測的新方法。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.31
【圖文】：

②無惡性疾��；③簽署知情同意書，同意使用其樣本及臨床資料。（4）對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦；②有感染、免疫性疾病、手術(shù)等嚴(yán)重的內(nèi)外科疾��；③惡性病家族史。（5）本研究退出標(biāo)準(zhǔn)：①入組后發(fā)現(xiàn)患者不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例，或符合排除標(biāo)準(zhǔn)的病例；②受試者撤回知情同意書，要求退出。根據(jù)知情同意書的規(guī)定，受試者有權(quán)中途退出試驗(yàn)，或受試者雖未明確退出試驗(yàn)，但不再接定期隨訪而失訪（也屬于退出，或稱脫落）。應(yīng)盡可能了解退出的原因，并加以記錄。入組流程見圖 1。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2015 級碩士研究生畢業(yè)論文1.2 實(shí)驗(yàn)流程的建立本研究在獲取患者知情同意后，抽取病例組術(shù)前肘靜脈血 10ml，健康成年外周肘靜脈血 10ml。采用差速離心法分離血漿和血細(xì)胞；分離提取血漿游NA，測其濃度，擬采用重亞硫酸鹽測序方法，捕獲 DNA 片段進(jìn)行注釋和甲基測，送廣州市基準(zhǔn)醫(yī)療有限公司臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室測序，測序完畢后所有生物與測序數(shù)據(jù)返還仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，隨后對測序結(jié)果進(jìn)一步分析和解讀，實(shí)驗(yàn)圖見圖 2。

圖 3.Anchor IRISTM構(gòu)建技術(shù)路線圖Fig 3. Flow chat of Anchor IRISTMLibrary construction.標(biāo)區(qū)域富集與上機(jī)測序區(qū)域富集及上機(jī)測序是通過定制目標(biāo)基因組區(qū)域的探針，與基因組，將目標(biāo)區(qū)域 DNA 富集后進(jìn)行高通量測序，本研究目標(biāo)區(qū)域富集及州市基準(zhǔn)醫(yī)療有限責(zé)任公司完成。我們定制了一個(gè)包含 9390 個(gè)腫瘤位點(diǎn)的測序 panel，測序深度為 10000X。原位雜交：使用 AnchorDxEpiVisioTMTarget Enrichment Kit，由于涉心技術(shù)，僅提供大致操作流程：NA 文庫與 HE、HBA 和 HBB 封閉液混合。用熱處理的真空系統(tǒng)進(jìn)行干燥。

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本文編號(hào)：2779017