發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 13:09

【摘要】：第一部分ARRDC3與子癇前期相關(guān)性的研究目的1.研究子癇前期胎盤組織中ARRDC3表達(dá)情況及缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞ARRDC3表達(dá)的影響。2.研究缺氧條件下ARRDC3表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及血管形成的影響。方法1.利用生物信息學(xué)方法分析四組子癇前期表達(dá)譜基因芯片中的差異表達(dá)基因,從差異表達(dá)基因中挑選出與缺氧代謝、細(xì)胞侵襲及血管形成相關(guān)的基因——ARRDC3。2.免疫組化檢測(cè)10例子癇前期胎盤組織樣本和10例正常胎盤組織樣本中ARRDC3表達(dá)分布,Western Blot檢測(cè)10例子癇前期胎盤組織樣本和10例正常胎盤組織樣本中ARRDC3蛋白的表達(dá)。3.建立絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞體外缺氧模型,Western Blot檢測(cè)缺氧對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞ARRDC3蛋白的表達(dá)的影響、EDU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖的影響、Transwell小室法檢測(cè)缺氧對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲能力的影響、Tube formation法檢測(cè)缺氧對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞血管形成能力的影響、流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法檢測(cè)缺氧對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響。4.構(gòu)建ARRDC3重組質(zhì)粒,用lipo2000轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)ARRDC3過(guò)表達(dá)效率,EDU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ARRDC3過(guò)表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖的影響、Transwell小室法檢測(cè)ARRDC3過(guò)表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲能力的影響、Tube formation法檢測(cè)ARRDC3過(guò)表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞血管形成能力的影響、流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法檢測(cè)ARRDC3過(guò)表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響。5.構(gòu)建 ARRDC3 特異性 siRNA,用 lipo2000 轉(zhuǎn)染 HTR8/SVneo 細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)ARRDC3沉默效率,Transwell小室法檢測(cè)ARRDC3沉默對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲能力的影響、Tube formation法檢測(cè)ARRDC3沉默對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞血管形成能力的影響、流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法檢測(cè)ARRDC3沉默對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響。6.應(yīng)用HIF-2 α抑制劑處理HTR8/SVneo細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)缺氧條件下HIF-2 α 及 ARRDC3 表達(dá)。結(jié)果1.利用生物信息學(xué)分析方法總共鑒定出277個(gè)共同的差異表達(dá)基因,其中ARRDC3與缺氧代謝、細(xì)胞侵襲及血管形成有關(guān)。免疫組化檢測(cè)顯示ARRDC3在胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)豐富,主要分布于細(xì)胞膜。Westren Blot檢測(cè)顯示子癇前期胎盤組織中ARRDC3表達(dá)顯著高于正常胎盤組織。2.體外絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞缺氧模型中,Westren Blot檢測(cè)顯示缺氧誘導(dǎo)HTR8/SVneo細(xì)胞ARRDC3表達(dá),EDU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示缺氧對(duì)HTR8/S Vneo細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響、Transwell小室法檢測(cè)顯示缺氧抑制HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲、Tube formation法檢測(cè)顯示缺氧抑制HTR8/SVneo細(xì)胞血管形成、流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法檢測(cè)顯示缺氧促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡。3.構(gòu)建的HTR8/SVneo細(xì)胞ARRDC3過(guò)表達(dá)模型中,Westren Blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染ARRDC3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒HTR8/SVneo細(xì)胞中ARRDC3表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組提高了(80.08±7.32)%,EDU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示ARRDC3過(guò)表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞增殖無(wú)影響、Transwell小室法檢測(cè)顯示ARRDC3過(guò)表達(dá)抑制HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲、Tube formation法檢測(cè)顯示ARRDC3過(guò)表達(dá)抑制HTR8/SVneo細(xì)胞血管形成、流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法檢測(cè)顯示ARRDC3過(guò)表達(dá)對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響。4.構(gòu)建的HTR8/SVneo細(xì)胞ARRDC3沉默模型中,Westren Blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染ARRDC3特異性siRNA的HTR8/SVneo細(xì)胞中ARRDC3表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組下降了(75.12 ± 5.30)%,Transwell小室法檢測(cè)顯示ARRDC3沉默促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲、Tube formation法檢測(cè)顯示ARRDC3沉默促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞血管形成。5.用HIF-2 α抑制劑處理HTR8/SVneo細(xì)胞后,Westren Blot檢測(cè)顯示缺氧條件下HIF-2 α抑制劑抑制不僅抑制HIF-2 α蛋白表達(dá)而且抑制ARRDC3蛋白表達(dá)。結(jié)論子癇前期胎盤組織中ARRDC3表達(dá)顯著高于正常胎盤組織。缺氧誘導(dǎo)HTR8/SVneo細(xì)胞ARRDC3表達(dá),抑制HTR8/SVneo細(xì)胞增殖、侵襲,促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞凋亡。ARRDC3的過(guò)表達(dá)抑制HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲及血管形成,ARRDC3的沉默促進(jìn)HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲及血管形成。缺氧條件下HIF-2 α誘導(dǎo)ARRDC3表達(dá)。研究結(jié)果揭示了 ARRDC3與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。第二部分子癇前期與胎盤血管重鑄障礙及母體血管因子紊亂的研究進(jìn)展(綜述)子癇前期是一種妊娠相關(guān)的特殊疾病,是圍產(chǎn)期孕婦及胎兒致病和死亡的主要原因。子癇前期發(fā)病機(jī)制不明,但胎盤螺旋動(dòng)脈重鑄障礙和血管生成因子及抗血管生成因子的失衡在子癇前期發(fā)生發(fā)展中起重要作用。母體外周循環(huán)血液中血管生成因子及抗血管生成因子可以用于子癇前期發(fā)病的預(yù)測(cè)及子癇前期新療法的開發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R714.244
【圖文】：

圖２．子癇前期與正常妊娠胎盤血管重鑄的比較ｔｊｋ意圖（引自Ｐｅｒｅ－Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ逡逑Ａｌ，ｅｔ邋ａｌ．邋Ｒｅｐｏｒｔ邋Ｓｃｉ．２０１３，２０（９）：邋１０２０－９．）逡逑為了探索缺氧條件下參與子癇前期發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，我們從ＧＥＯ數(shù)據(jù)逡逑庫(kù)下載了與子癇前期相關(guān)的四個(gè)基因芯片，利用生物信息學(xué)分析篩選出了目標(biāo)逡逑基因一含有抑制蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白３（Ａｒｒｅｓｔｉｎ邋Ｄｏｍａｉｎ邋Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋３，ＡＲＲＤＣ３）。逡逑ＡＲＲＤＣ３是ａ邋－抑制蛋白家族成員，它與哺乳動(dòng)物ｐ邋—抑制蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)逡逑域［１２］，邋ＡＲＲＤＣ３含有兩個(gè)Ｃ末端ＰＰＸＹ基序，它們可以結(jié)合含ＷＷ結(jié)構(gòu)域的逡逑蛋白質(zhì)，包括含ＨＥＣＴ結(jié)構(gòu)域的Ｎｃｄｄ４樣Ｅ３泛素連接酶［１２］。先前的研究表明逡逑ａ邋－抑制蛋白家族成員充當(dāng)銜接子／支架將Ｎｃｄｄ４樣Ｅ３泛素連接酶募集至其底物逡逑以降解［１３］。最近研究發(fā)現(xiàn)，ＡＲＲＤＣ３與癌癥有著密切關(guān)聯(lián)，ＡＲＲＤＣ３已成為逡逑調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能的腫瘤抑制因子［１４－１６］。過(guò)去幾十年的研究表明，滋養(yǎng)細(xì)胞逡逑和癌細(xì)胞在增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞行為學(xué)功能上具有極其相似的特征［１７］，逡逑

出了７８７３，邋３８１４，邋１１９７９邋和邋１３２８邋個(gè)差異表達(dá)基因（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ，逡逑ＤＥＧｓ），對(duì)四個(gè)基因表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因取交集，得到２７７個(gè)共同逡逑表達(dá)的差異表達(dá)基因（圖１Ａ）。本研究主要聚焦缺氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞行為學(xué)的逡逑變化研宄，尤其是侵襲和血管形成功能，通過(guò)生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)逡逑在２７７個(gè)基因中ＡＲＲＤＣ３涉及到細(xì)胞的侵襲、血管形成及缺氧相關(guān)代謝。為了驗(yàn)逡逑證ＡＲＲＤＣ３在子癇前期發(fā)生發(fā)展中的潛在作用，利用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ分逡逑別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)ＡＲＲＤＣ３在子癇前期胎盤組織和正常胎盤組織中逡逑表達(dá)差異，結(jié)果顯示ＡＲＲＤＣ３的ｍＲＮＡ及ＡＲＲＤＣ３蛋白表達(dá)水平在子癇前期胎逡逑盤組織中均明顯高于正常胎盤組織（圖１Ｂ＆Ｃ＆Ｄ）。利用免疫組化檢測(cè)逡逑ＡＲＲＤＣ３在胎盤組織中的定位及表達(dá)，結(jié)果顯示ＡＲＲＤＣ３在胎盤各層中都有表逡逑達(dá)，主要在滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)表達(dá)，且子癇前期胎盤組織逡逑中陽(yáng)性染色強(qiáng)度明顯大于正常胎盤組織（圖１Ｅ）。逡逑２２逡逑

圖２缺氧缺氧誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ中ＡＲＲＤＣ３的表達(dá)圖逡逑Ａ－Ｂ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測(cè)顯示缺氧增加滋養(yǎng)細(xì)胞ＡＲＲＤＣ的蛋白水平表達(dá)。Ｃ：細(xì)胞逡逑免疫熒光顯示缺氧和常氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞ＡＲＲＤＣ３的表達(dá)水平；逡逑＊＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０１．逡逑２．３缺氧調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞行為學(xué)功能逡逑在人絨膜外滋養(yǎng)細(xì)胞系ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ構(gòu)建滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧模型中，ＥＤＵ增逡逑殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧２４小時(shí)對(duì)ＴＲ８／ＳＶｎｅｏ細(xì)胞增殖的影響，如圖３Ａ、３Ｂ所示逡逑１°／０0２缺氧２４小時(shí)ＴＲ８／ＳＶｎｅｏ細(xì)胞增殖率與常氧組沒有顯著差異（Ｐ＞０．０５）。逡逑Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室法檢測(cè)１％０２缺氧２４小時(shí)對(duì)ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ細(xì)胞侵襲能力的影響，逡逑如圖３Ｃ、３Ｄ所示缺氧組侵襲到Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室下表面的細(xì)胞數(shù)與常氧組相比明逡逑顯減少（Ｐ＜0．0５），分別為（４５．３８±４．２７）、（８０．５６±５．６７）。小管形成法檢測(cè)１％０２缺逡逑氧２４小時(shí)對(duì)ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ細(xì)胞血管形成能力的影響。如圖３Ｅ、３Ｆ所示，缺氧逡逑Ｐ＜．，．．、逡逑

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本文編號(hào)：2776515