【摘要】：研究背景及目的:胎兒生長受限(FGR)在我國的發(fā)生率為8.77%,是圍生兒死亡的第二大原因。有研究表明脂肪生成障礙是生長受限胎兒與正常胎兒的主要區(qū)別之一,而過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是調(diào)節(jié)脂糖代謝,促進脂肪分化成熟最重要的因子。本項目擬應用分子生物學、細胞生物學、藥理學等方法從組織、細胞、個體三個層次闡明滋養(yǎng)細胞PPARγ經(jīng)外泌體介導的母胎界面的對話機制,探討以滋養(yǎng)細胞PPARγ為靶點調(diào)控胎兒脂肪生成的可行性,為FGR防治提供新的思路和證據(jù)。方法:(1)收集正常妊娠及FGR妊娠胎盤組織,利用RT-qPCR、western blotting、免疫熒光及免疫組化等方法檢測胎盤組織中PPARγ及其磷酸化水平、脂代謝相關(guān)因子SREBP1、C/EBPα、SIRT1、PGC-1α及ACC的表達水平及其活性形式;油紅O染色檢測胎盤組織中脂肪形成狀況以確定FGR胎盤與正常胎盤是否存在PPARγ表達及活性變化、脂質(zhì)代謝紊亂及兩者間的聯(lián)系。(2)構(gòu)建由Tet-on系統(tǒng)介導的條件性PPARγ敲降慢病毒(Tet PPARγ-knockdown)并轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo滋養(yǎng)細胞株及3T3-L1前脂肪細胞株,隨后用HTR8/SVneo、Tet PPARγ-KD HTR8/SVneo及Tet NC HTR8/SVneo細胞或其上清液中的外泌體分別與3T3-L1、Tet PPARγ-KD 3T3-L1及Tet NC 3T3-L1進行共培養(yǎng)并誘導分化,利用油紅O染色、RT-qPCR等方法檢測前脂肪細胞的分化成熟狀況及脂質(zhì)代謝相關(guān)因子的表達情況;(3)利用RUPP手術(shù)構(gòu)建FGR動物模型,于孕13.5天開始每天通過尾靜脈注射胎盤靶向納米顆粒包裹的PPARγ激動劑羅格列酮,于孕18.5天處死孕鼠,用物理學方法對胎鼠進行形態(tài)學測量;用DXA對胎鼠進行體成分分析;用western blotting、RT-qPCR、油紅O染色等方法檢測孕鼠胎盤組織PPARγ活性變化、胎鼠脂肪組織生成狀況及其脂肪代謝相關(guān)因子的表達情況;(4)標記老鼠胎盤來源的外泌體并通過尾靜脈注射入孕鼠體內(nèi),隨后利用雙光子顯微鏡、小鼠活體成像及共聚焦顯微鏡檢測標記的外泌體以探索外泌體在母胎對話間的作用;(5)收集不同孕周老鼠的胎盤組織、胎鼠及不同的胎鼠器官,利用共聚焦顯微鏡、western blotting等方法檢測PPARγ在胎盤、胎鼠及不同胎鼠器官中的表達以明確孕期胎盤滋養(yǎng)細胞PPARγ對胎鼠生長發(fā)育尤其是脂肪生成的必要性。結(jié)果:(1)正常及FGR妊娠的胎盤組織實驗顯示,PPARγ在FGR胎盤組織中的表達水平及活性均明顯降低,脂肪酸代謝通路中的各種因子如ACC及PGC-1α的活性在FGR胎盤組織中均有不同程度下降,而各孕周胎盤組織油紅O染色并未發(fā)現(xiàn)胎盤組織本身存在脂肪生成差異。(2)HTR8/SVneo細胞與3T3-L1細胞共培養(yǎng)可明顯促進3T3-L1及Tet PPARγ-KD 3T3-L1前脂肪細胞的分化成熟,而PPARγ敲降后的HTR8/SVneo細胞對3T3-L1細胞的分化成熟不再具有促進作用,與HTR8/SVneo-3T3-L1細胞共培養(yǎng)相比,HTR8/SVneo細胞上清液外泌體與3T3-L1細胞共培養(yǎng)具有同樣的促前脂肪細胞分化作用,而去外泌體的HTR8/SVneo上清液及PPARγ敲降后的HTR8/SVneo外泌體對3T3-L1的分化成熟不再具有促進作用。(3)動物實驗表明,RUPP手術(shù)可導致明顯的胎鼠生長發(fā)育遲緩、胎鼠脂肪組織百分比下降,而從孕中期開始使用PPARγ激動劑羅格列酮之后,胎鼠的生長發(fā)育及胎鼠脂肪組織百分比均顯著改善,且胎鼠脂肪組織中的脂肪代謝相關(guān)調(diào)控分子的表達均有不同程度的變化。(4)小鼠活體成像、雙光子顯微鏡及共聚焦顯微鏡結(jié)果均顯示,孕鼠胎盤組織分泌的外泌體可通過臍帶轉(zhuǎn)運至胎鼠體內(nèi)。(5)各孕周孕鼠胎盤、胎鼠及不同胎鼠器官PPARγ表達檢測顯示,PPARγ在整個孕期的胎盤組織中均處于高表達狀態(tài),其表達量遠遠高于胎鼠的不同器官組織。結(jié)論:(1)FGR胎盤組織中存在PPARγ表達及活性下降以及脂質(zhì)代謝紊亂;(2)滋養(yǎng)細胞PPARγ可經(jīng)外泌體介導進入前脂肪細胞并顯著改善其分化成熟;(3)孕期胎鼠所需的PPARγ依賴于胎盤組織通過胎盤分泌外泌體提供,在孕期上調(diào)胎盤PPARγ活性可顯著改善胎鼠生長發(fā)育及脂肪生成。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714.5
【圖文】：

而增強細胞間信息傳遞、易化細胞間對話[24,25]。研究表明[26,27]：早在妊娠第 6 周，即可在母血中檢測到胎盤滋養(yǎng)細胞來源的外泌體，且隨著妊娠的進展，母體血漿中胎盤滋養(yǎng)細胞來源的外泌體會不斷增加，至孕晚期，母體血漿中胎盤滋養(yǎng)細胞來源的外泌體將比孕早期高約 10 倍。妊娠期糖尿�。℅DM）早、中、晚孕期母體血漿中胎盤來源的外泌體均明顯高于同孕齡正常孕婦，且從 GDM 孕婦血漿中提取的外泌體可有效刺激內(nèi)皮細胞釋放炎癥因子[26]。分別從早、中、晚孕期孕婦血漿中提取的外泌體均可明顯促進血管形成及內(nèi)皮細胞增殖、遷移[26,27]。由此可見，妊娠期胎盤來源的外泌體對胎盤形成及發(fā)育、母胎對話具有重要作用。綜上所述，我們推測胎盤滋養(yǎng)細胞 PPARγ與/或其下游效應分子，經(jīng)外泌體運輸，實現(xiàn)與胎兒前脂肪細胞的對話并調(diào)控其向成熟脂肪細胞分化，促進胎兒脂肪生成（圖 1 研究假說示意圖）。因此，妊娠胎盤滋養(yǎng)細胞 PPARγ活性異常，可能引起胎盤脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝失衡及胎兒脂肪生成障礙，并最終導致 FGR 發(fā)生。

人正常及FGR妊娠胎盤組織PPARγ表達及活性檢測Figure1.1PPARγexpressionandactivationdetectioninhumannormalandFGRplacentatissuesA:ConfocalimagesofPPARγimmuofluorescentstaininginhumannormalandFGRtermplacentatissues.B:RT-qPCRshowingrelativePPARγmRNAexpressioninhumannormalandFGR

.2 正常及 FGR 胎盤組織脂肪代謝相關(guān)指標bolism related factors detection in human notissueshowing relative C/EBPα、SREBP1 precursorplacenta tissues, n=7 in each group. B: Weste (t-ACC) expression in human normal and Flotting showing relative SIRT1 and PGC-1α e, n=7 in each group. Data were presented as ing normal group.及胎兒皮下脂肪 PPARγ表達及脂果顯示：在妊娠 14 周、17 周、21 周-PPARγSer273及 PPARγ的總蛋白表達量不同孕周胎盤組織免疫組化檢測同樣發(fā)

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本文編號：2776902