發(fā)布時(shí)間：2020-07-25 14:34

【摘要】：背景與目的近年來(lái),隨著生活節(jié)奏加快、工作壓力增加、環(huán)境污染惡化、飲食結(jié)構(gòu)改變等,不孕癥已成為全球性的公共健康問(wèn)題。除女性排卵障礙及輸卵管功能障礙兩大不孕因素外,男性因素導(dǎo)致不育也越來(lái)越常見(jiàn),并且許多研究表明男性精子數(shù)量和生育能力在不斷的下降。引起精子質(zhì)量下降的因素很多,其中包括有毒環(huán)境的暴露、精索靜脈曲張、物理及精神因素。隨著分子生物學(xué)及基因研究的不斷深入,一些學(xué)者進(jìn)一步將目光投向了精子線粒體,有國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)線粒體基因片段缺失與男性不育之間有著密切的關(guān)系。我們前期探討了精子線粒體基因MT-ATP6、MT-ND3、MT-ND6及MT-ND2等基因變異與體外完全受精失敗的相關(guān)性,但MT-CO1基因的變異情況我們尚不了解。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)近5年人精子線粒體CO1基因發(fā)生了較為明顯的變異,而且基因變異具有一定的規(guī)律性。因此,我們嘗試探討漢族人精子線粒體CO1基因變異是否影響男性精子質(zhì)量及與完全體外受精失敗的相關(guān)性。研究方法1樣本的收集1.1:收集2010-2018年就診于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心的343例IVF周期男性患者的精液進(jìn)行回顧性分析。1.2:收集2018年9月-11月就診于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診的19位產(chǎn)褥期女性志愿者,各取2ml外周靜脈血,門診收集8名兩周歲之內(nèi)的嬰幼兒外周靜脈血各1ml。1.3:征集6名男性志愿者取其精液、外周靜脈血及其親生母親外周靜脈血。1.4:收集5位男性不同年份(2012年及2018年)的精子進(jìn)行研究對(duì)象的自身前后對(duì)照研究。1.5:于2018年9-11月在我生殖中心收集40余枚卵胞漿單精子注射過(guò)程中廢棄的未成熟卵子。2實(shí)驗(yàn)方法2.1通過(guò)巢式PCR和DNA測(cè)序分析線粒體CO1基因的變異情況,檢測(cè)結(jié)果經(jīng)mitomap數(shù)據(jù)庫(kù)(www.mitomap.org)中記錄的人類劍橋序列(rCRS)進(jìn)行比對(duì),并記錄變異位點(diǎn)。2.2應(yīng)用Uniport datebase和Polyphen-2軟件對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè);swiss-model軟件同源建模預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)并通過(guò)TM-Align軟件計(jì)算野生型蛋白及突變型蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)之間的RMSD差值,評(píng)估SNP對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。2.3將343例精子樣本根據(jù)年份分組,觀察其線粒體CO1基因變異情況;評(píng)價(jià)人精子線粒體CO1基因變異是否影響男性精子質(zhì)量及與完全體外受精失敗的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料應(yīng)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,分類計(jì)數(shù)資料應(yīng)用數(shù)和百分比表示。計(jì)量資料用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析。所有分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有樣本數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果1.漢族精子線粒體測(cè)序共發(fā)現(xiàn)75個(gè)純合變異,66個(gè)雜合變異,其中新發(fā)現(xiàn)純合位點(diǎn)1個(gè),新發(fā)現(xiàn)雜合位點(diǎn)11個(gè)。2.觀察精子線粒體CO1基因所有變異位點(diǎn),我們發(fā)現(xiàn)自2014年起,精子線粒體CO1基因除了散在位點(diǎn)的變異以外,開(kāi)始出現(xiàn)一組由G6023A、T6221C、C6242T、A6266C、A6299G、G6366A、G6383A、C6410T、C6452T、C6483T、T6512C、C6542T、C6569A、T6641C、C6935T、C6938T、A7146G、C7232T、C7256T和G7316A這20個(gè)固定位點(diǎn)組成的特異性的基因變異及C7028T位點(diǎn)的回復(fù)變異。我們?cè)诒疚闹袑?0個(gè)固定變異位點(diǎn)的線粒體CO1基因定義為變異型基因,20個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生變異的線粒體CO1基因定義為野生型基因。線粒體CO1變異型基因在血液樣本中均未檢測(cè)到。3.精子線粒體CO1變異型基因中G6366A和A7146G兩個(gè)位點(diǎn)變異為錯(cuò)義變異,經(jīng)蛋白功能預(yù)測(cè)提示這兩處錯(cuò)義變異對(duì)蛋白質(zhì)功能影響并不明顯。經(jīng)swiss-model軟件同源建模預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型蛋白R(shí)MSD=0.1;變異型蛋白R(shí)MSD=1.24,提示變異型蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)比野生型蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有所下降。4.精子密度在野生型基因組及變異型基因組之間無(wú)明顯差異,P0.05;精子活力(a+b級(jí))在兩組間有差異,野生型基因組精子平均活力明顯高于變異型基因組,P0.05。5.精子線粒體CO1變異型基因與體外完全受精失敗無(wú)明顯相關(guān)性,P0.05。6.分析每一個(gè)精子線粒體CO1基因的每一個(gè)變異位點(diǎn),我們發(fā)現(xiàn)2010至2013年,純合變異位點(diǎn)T5999C(0%vs 5.26%)、G6179A(0%vs 5.26%)、C7028T(87.64%vs 71.05%)和雜合變異位點(diǎn)A7241G(0%vs 5.26%)在正常受精組與完全受精失敗組之間有差異,P0.05;2014至2018年,純合變異位點(diǎn)G6383A(59.34%vs 38.89%)、C7028T(17.58%vs 47.22%)、C7232T(53.85%vs 33.33%)和雜合變異位點(diǎn)G6023A(38.46%vs 11.11%)、T6221C(38.46%vs 13.89)、C6242T(39.56%vs 13.89%)、A6299G(46.15%vs 13.89%)、G6366A(50.55%vs16.67%)、C6410T(39.56%vs 13.89%)、C6452T(37.36%vs 13.89%)、C6483T(38.46%vs 13.89%)、T6512C(54.95%vs 16.67%)、C6542T(45.05%vs 13.89%)、C6569A(40.66%vs 13.89%)、T6641C(31.87%vs 13.89%)、C6935T(43.96%vs16.67%)、C6938T(42.86%vs 13.89%)、C7028T(52.75%vs22.22%)、A7146G(34.07%vs13.89%)、C7232T(31.87%vs13.89%)、C7256T(58.24%vs16.67%)、G7316A(48.35%vs25%)在正常受精組與完全受精失敗組之間有差異,P0.05。結(jié)論近8年漢族人精子線粒體CO1基因出現(xiàn)了一組以G6023A等20個(gè)位點(diǎn)基因變異及C7028T位點(diǎn)的回復(fù)變異為特征的變異,我們將G6023A等20個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生變異的線粒體CO1基因定義為變異型基因,變異型基因編碼蛋白質(zhì)仍具有一定的生物學(xué)功能,但其空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有所降低。精子線粒體CO1基因變異對(duì)精子密度無(wú)明顯影響,但可能是引起精子活力下降的原因之一。漢族人精子線粒體CO1基因變異對(duì)體外受精失敗的影響不是一成不變的,而是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程中。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714.8
【圖文】：

型（b）CO1 基因編碼蛋白模擬三維結(jié)構(gòu)圖；野）、野生型位點(diǎn) 7146A（e）、變異位點(diǎn) 7146G（男性精子、靜脈血和其母親靜脈血的 M男性中有 5 例精子線粒體基因 6023 位點(diǎn)發(fā)位點(diǎn)均為 G。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 3、波形圖見(jiàn)子精子、靜脈血和其母親靜脈血 MT-CO1 基因

10圖 2：男子精子、靜脈血及其母親靜脈血 6023 位點(diǎn)對(duì)比波形圖 2. 3 組樣本男方精子、靜脈血及其母親靜脈血的 6023 位點(diǎn)波形圖。1 號(hào)男性精子、靜及其母親靜脈血中 6023 位點(diǎn)均為野生型 G；2 號(hào)及 5 號(hào)男子精子線粒體 6023 位點(diǎn)均發(fā) G/A 的雜合變異，靜脈血中均為野生型。1.4 經(jīng)過(guò)對(duì) 5 組男性不同時(shí)期（2012 年及 2018 年）的精子的 MT-CO1 基023 位點(diǎn)的檢測(cè)自身比對(duì)顯示：5 名男性 2012 年精子線粒體 6023 基因位點(diǎn)

11圖 3：自身對(duì)比基因波形圖野生型，A 為變異型。NO.1-2012 為 1 號(hào)志愿者 20野生型 G，NO.1-2018 為 1 號(hào)志愿者 2018 再次取精后O.3-2012 為 3 號(hào)志愿者 2012 年精子樣本 6023 位點(diǎn)檢志愿者 2018 年再次取精對(duì) 6023 位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果改：19 位產(chǎn)褥期女性靜脈血、8 名兩周歲之內(nèi)的

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本文編號(hào)：2769954