【摘要】：目的:探討γ珠蛋白基因(HBG)啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)對輕型β-地中海貧血胎兒血紅蛋白(HbF)表達(dá)的影響;對全基因組的甲基化位點進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選出可能與HbF表達(dá)相關(guān)的差異甲基化基因、生物信號通路,為β-地中海貧血治療提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。方法:收集301例輕型β-地中海貧血患者的外周抗凝靜脈血各2ml。提取DNA后對其進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換,PCR擴增含有目的甲基化位點的片段,用焦磷酸測序方法,定量檢測HBG啟動子區(qū)的甲基化程度,分析HBG啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與HbF表達(dá)的相關(guān)性。收集足月產(chǎn)新生兒臍血8例、早產(chǎn)新生兒臍血8例,通過磁珠分選方法提取新生兒臍血中的有核紅細(xì)胞,提取DNA后對其進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,采用Illumina Infinium?Human Methylation850 Bead Chip芯片,對全基因組甲基化位點進(jìn)行檢測。依次采用R軟件minfi包、R軟件IMA包處理原始數(shù)據(jù),篩選出兩組間的差異甲基化位點、差異甲基化基因(篩選差異甲基化位點的標(biāo)準(zhǔn)為:差異顯著p值0.05,|beta.difference|0.14),對其進(jìn)行GO功能分析、KEGG通路分析與Hb F表達(dá)相關(guān)的基因和信號通路。結(jié)果:由于HBG1和HBG2具有高度同源性,兩者啟動子區(qū)的CpG位點一致,HBG啟動子區(qū)共包含5個甲基化位點,分別為-53、-50、+5、+16、+49位點。在定量分析上5個位點的甲基化程度與HbF的表達(dá)均無顯著相關(guān)性(p0.05)。在定性分析上,5個位點均呈現(xiàn)出高度甲基化或中度甲基化,未發(fā)現(xiàn)低甲基化。根據(jù)HbF的表達(dá)量對標(biāo)本進(jìn)行分組,組間甲基化程度沒有顯著性差異(p0.05);根據(jù)甲基化程度對標(biāo)本進(jìn)行分組,僅+49位點不同甲基化程度的HbF表達(dá)量有顯著性差異(p0.05);其它4個位點不同甲基化程度的HbF表達(dá)量均沒有顯著性差異(p0.05)。llumina 850K芯片技術(shù)檢測結(jié)果:相對于早產(chǎn)組,足月組共篩選差異甲基化位點4749個,包括低甲基化位點4359個,高甲基化位點390個;差異甲基化位點對應(yīng)差異甲基化基因2600個。差異基因經(jīng)GO分析顯示與造血相關(guān)的生物過程:正向調(diào)節(jié)Wnt信號通路共富集到4個差異基因(ABL2、DAB2、ANKRD6、MLLT3),在足月組中均為低甲基化;KEGG分析顯示與造血相關(guān)的Nothch通路上共富集到14個差異基因,低甲基化的基因有11個(CREBBP、PSEN2、KAT2B、LFNG、CTBP2、MAML3、DTX3L、NUMB、NOTCH1、HDAC1、RBPJ),高甲基化的基因有3個(NCOR2、MAML2、PTCRA)。結(jié)論:輕型β-地中海貧血患者HBG啟動子區(qū)呈高度或中度甲基化,抑制HbF的表達(dá),但兩者之間在定量水平上沒有顯著相關(guān)性;全基因組甲基化芯片生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Wnt和Notch信號通路可能與HBG的表達(dá)調(diào)控有關(guān),為后續(xù)進(jìn)一步研究HBG的表達(dá)調(diào)控機制提供了新的研究靶點。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.54
【圖文】：

所以在預(yù)測甲基化島時，結(jié)果一致，如圖 1-1 所示：在 HBG 基因動子區(qū)（TSS 上游-2000bp~TSS 下游 200bp）沒有預(yù)測到符合條件的 CpG 島是在啟動子區(qū) 5,248,392~5,248,641（Human GRCH38/hg38）（-137，+113）存 5 個甲基化位點（-53、-50、+5、+16、+49），結(jié)合文獻(xiàn)[28]，本實驗將這 5 個基化位點作為研究靶點。

1-2 ：建好的程序，檢測 1~8 號標(biāo)本（-53、-50）位點、（+5、+16）位點、+49 點共 40 個位點的甲基化程度igure1-2：Builted New Run,detection 40 methylation sites of 1~8 samples’-53、-50、++16、+49sites測序引物的稀釋及試劑倉的加樣用試劑 Annealing Buffer 將焦磷酸測序引物稀釋至 0.3μM，并吸取 25.4μl Run 中待測位點對應(yīng)的測序引物至 Q24 反應(yīng)板中。分別向?qū)?yīng)的試劑倉足量的酶：E，底物：S，堿基：A、T、G、C，以備測序時用。單鏈的分離打開真空工具開關(guān)，將振搖的八聯(lián)管打開蓋子并放入儀器上，將真空工具聯(lián)管中持續(xù) 20s，以捕獲 PCR 產(chǎn)物；將真空工具快速放入試劑槽 1（70%）中沖洗 10s；將真空工具放入試劑槽 2 變性溶液（PyroMark Denaturation so洗 10s；再將真空工具放入試劑槽 3 洗滌液（PyroMark Wash Buffer）中沖

圖 2-1：基因、CpG 島注釋分類后的探針分布圖2-1:The probe distribution of annotated classification map of Gene、Cp甲基化基因的 GO 富集分析選出的差異甲基化區(qū)域涉及的所有基因進(jìn)行 GO 分析，通過生得到相應(yīng)條目富集到的基因。篩選差異 DMR（different met同區(qū)域甲基化 ）相關(guān)基因中顯著富集的 GO 條目，其計算公所有基因中具有 GO 注釋的基因數(shù)目；n 為 N 中差異 DMR 相 為所有基因中注釋為某特定 GO term 的基因數(shù)目；m 為注釋 的差異 DMR 相關(guān)基因數(shù)目。計算得到的 p-value 通過 Bonfe corrected p-value（FDR）≤0.05 為閾值，滿足此條件的 GO te

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