【摘要】：第一部分血清外泌體microRNAs在卵巢癌診斷中的應(yīng)用價值目的:研究表明,腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中含有大量的microRNAs,其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),本研究初步探討血清外泌體中microRNAs在卵巢癌中的應(yīng)用價值。方法:1.收集外周血標(biāo)本:卵巢癌40人,良性卵巢腫瘤15人,健康對照30人。2.采用Minute高效外泌體沉淀方法對血清中外泌體進(jìn)行提取并使用Western blot對外泌體蛋白CD9和CD63的表達(dá)進(jìn)行鑒定,應(yīng)用miRNA純化試劑盒提取外泌體中miRNAs。3.應(yīng)用實時熒光定量PCR法對外泌體中miR-101-3P、miR-320a、miR-3184和miR-1246表達(dá)量進(jìn)行檢測,應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.我們通過外泌體沉淀法提取出了血清中的外泌體,Western blot結(jié)果顯示提取的外泌體高表達(dá)CD9和CD63蛋白。2.本次研究初篩入選了4個腫瘤相關(guān)microRNAs分別為miR-101-3P、miR-320a、miR-3184和miR-1246。初篩組中我們納入了15名卵巢癌和15名健康對照,實時定量PCR結(jié)果顯示,miR-101-3P,miR-320a和miR-1246在卵巢癌組和健康對照組中的穩(wěn)定表達(dá),miR-101-3P和miR-320a在初篩組的卵巢癌組和健康對照組中的表達(dá)沒有顯著性差異(P0.05),僅miR-1246在初篩組的兩組間具有差異性表達(dá)(P0.05)。3.驗證組中分為25名卵巢癌患者,15名良性卵巢腫瘤以及15名健康對照。實時定量PCR結(jié)果表明,miR-1246在卵巢癌組中表達(dá)明顯高于良性卵巢腫瘤組和健康對照組,差異具有顯著性(P0.05)。良性卵巢腫瘤中miR-1246的表達(dá)高于健康對照組,但是差異并不顯著(P0.05)。4.對25例卵巢癌患者進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示,miR-1246、CA125以及二者聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積分別為0.819、0.898和0.909。通過ROC曲線求得miR-1246的cutoff值為9.947,血清外泌體中miR-1246以及CA125的靈敏度為0.680和0.800,特異度分別為0.897和0.735.聯(lián)合診斷可以提高miR-1246的靈敏度和診斷效能。5.通過雙變量相關(guān)性分析血清外泌體中miR-1246表達(dá)量與血清CA125和HE4水平,結(jié)果表明miR-1246與CA125和HE4均呈顯著正相關(guān)(CA125,r=0.644,P=0.001;HE4,r=0.581,P=0.002)。6.雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miR-1246的相對表達(dá)水平與年齡(r=-0.291,P=0.703)和卵巢癌的組織學(xué)類型無關(guān)(r=0.111,P=0.597)。miR-1246與疾病分期(r=0.607,P=0.005),腹盆腔及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(r=0.485,P=0.014),CA125陽性表達(dá)水平(r=0.430,P=0.032)等相關(guān)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清外泌體miR-1246表達(dá)具有顯著性差異,有潛力作為新一代卵巢癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。第二部分mi R-1246對卵巢癌細(xì)胞株生物學(xué)行為影響的體外研究目的:第一部分結(jié)果顯示,mi R-1246在卵巢癌患者血清外泌體表達(dá)具有顯著性差異,本部分研究mi R-1246分子對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲、增殖和凋亡的影響方法:1.實驗分為兩組,分別為mi R-1246低表達(dá)組包括mi R-1246 inhibitor組和mi R-1246 inhibitor NC組以及mi R-1246高表達(dá)組包括mi R-1246mimic組和mi R-1246 mimic NC組。分別用mi R-1246 inhibitor、mi R-1246inhibitor NC、mi R-1246 mimic以及mi R-1246 mimic NC轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞。2.應(yīng)用實時定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞中mi R-1246的表達(dá)情況。3.采用細(xì)胞劃痕實驗觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞橫向遷移能力的改變,采用Transwell小室技術(shù)來檢測卵巢癌細(xì)胞的縱向遷移和侵襲能力。4.使用CCK-8法測定評估細(xì)胞增殖率。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果:1.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示mi R-1246 mimic組的SKOV3細(xì)胞中mi R-1246表達(dá)水平量明顯高于mi R-1246 mimic NC組(P0.05),mi R-1246inhibitor組中mi R-1246表達(dá)水平量明顯低于mi R-1246 inhibitor NC組(P0.05)。2.細(xì)胞劃痕實驗檢測卵巢癌細(xì)胞橫向遷移率,結(jié)果表明mi R-1246mimic組的細(xì)胞遷移率明顯高于mi R-1246 mimic NC組(P0.05),mi R-1246 inhibitor組的細(xì)胞遷移率明顯低于mi R-1246 inhibitor NC組(P0.05)。3.Transwell實驗結(jié)果顯示,與mi R-1246 mimic NC組相比,mi R-1246mimic組的細(xì)胞遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P0.05)。mi R-1246inhibitor組的遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于mi R-1246 inhibitor NC組(P0.05),說明mi R-1246抑制劑明顯抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P0.05)以及mi R-1246具有促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力。4.CCK-8細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比較于mi R-1246 mimic NC組,mi R-1246 mimic組的細(xì)胞增殖能力顯著提高(P0.05);mi R-1246inhibitor組的細(xì)胞增殖能力與mi R-1246 inhibitor組相比顯著下降(P0.05)。實驗說明mi R-1246可促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的增殖。5.細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果表明mi R-1246 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率相較于mi R-1246 inhibitor NC組顯著升高(P0.05);mi R-1246 mimic組的細(xì)胞凋亡率相較于mi R-1246 mimic NC組顯著下降(P0.05),這說明mi R-1246可抑制SKOV3卵巢癌細(xì)胞的凋亡。結(jié)論:通過卵巢癌細(xì)胞體外實驗可知,mi R-1246在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促癌基因的作用,可以提高卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲,促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31
【圖文】：

Westenblot檢測外泌體表面標(biāo)志分子Fig.1Westernblotanalysisofexosomesurfacemarkermolecules

初篩組中候選microRNA的PCR擴(kuò)增曲線圖

初篩組中候選miRNAs的熔解曲線

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳燕;林鶯鶯;鄭瑜宏;胡敏華;陳巖松;;血清HE4、CA125和ROMA指數(shù)評估卵巢癌風(fēng)險性的初步評價[J];中國免疫學(xué)雜志;2013年02期

本文編號：2766818