【摘要】：第一部分重度子癇前期患者特異性i PS細(xì)胞系的建立目的用仙臺病毒將重度子癇前期患者臍血CD3+T細(xì)胞重編程為iPSC,建立重度PE患者特異性的i PS細(xì)胞系。方法利用Ficoll梯度分離法分離重度PE患者的3ml臍血中單個(gè)核細(xì)胞,待T細(xì)胞在CD3和IL-2的激活作用下擴(kuò)增5-7天后用攜帶OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC基因的仙臺病毒轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染出現(xiàn)的IPSC克隆種植在飼養(yǎng)層MEF培養(yǎng)。對IPSC進(jìn)行堿性磷酸酶染色,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測多潛能分子標(biāo)志物OCT4,TRA-1-60,NANOG,SOX2,細(xì)胞株體外傳代及擴(kuò)增后進(jìn)行核型分析。結(jié)果仙臺病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞10-15天出現(xiàn)多個(gè)IPSC克隆,轉(zhuǎn)染效率0.02-0.04%。這些IPSC堿性磷酸酶染色陽性,表達(dá)多能性標(biāo)志物,傳至40代后核型仍正常。結(jié)論重度PE患者少量臍血樣本可經(jīng)仙臺病毒高效重編程為IPSC,IPSC具有全能性,擴(kuò)大了IPSC的來源細(xì)胞標(biāo)本,延伸了IPSC的臨床應(yīng)用,為探索PE為代表的滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育異常相關(guān)疾病奠定了良好基礎(chǔ)。第二部分無飼養(yǎng)層下特異性iPSC定向分化為滋養(yǎng)樣細(xì)胞目的iPSC轉(zhuǎn)至無飼養(yǎng)層上穩(wěn)定培養(yǎng)后在小分子(BMP4)的作用下將重度子癇前期患者特異性iPSC定向分化為滋養(yǎng)樣細(xì)胞。方法選擇狀態(tài)良好的iPSC種植在提前包被Matrigel的六孔板里傳代后改用m TeSR1基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)iPSC,接著利用含10ng/ml人BMP4的無飼養(yǎng)層基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7天誘導(dǎo)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(CTB)分化后繼續(xù)分化至功能性滋養(yǎng)樣細(xì)胞。動態(tài)觀察分化后細(xì)胞形態(tài)變化,免疫檢測滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)志物順序表達(dá),檢測滋養(yǎng)細(xì)胞HCG分泌。結(jié)果IPSC在無飼養(yǎng)層條件下多次傳代后仍狀態(tài)良好,分化后的細(xì)胞形態(tài)為滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài),表達(dá)CTB標(biāo)志物CDX2,且第6天時(shí)陽性率最高大于80%,繼續(xù)分化可表達(dá)EVT特異性標(biāo)志物HLA-G、分泌HCG。結(jié)論重度子癇前期患者的IPSC可在無飼養(yǎng)層下經(jīng)BMP4高效分化為CTB,且可繼續(xù)分化為具有分泌功能的滋養(yǎng)樣細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R714.244
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文出凍存管，快速放入 37 度水浴鍋中確保在 1min 內(nèi)解凍細(xì)胞懸液。吸出細(xì)胞懸液，緩慢滴入已經(jīng)準(zhǔn)備好的離心管中，離心 1000rx5min。③棄上清，加 IPSC 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照凍存管上標(biāo)記的密度接種于 MEF 上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 培養(yǎng) PBMC。利用 Ficoll 液分離臍血后得到的第二層白膜層即為 T 細(xì)胞層，呈“云霧狀”，界線肉眼可見（圖 1）。初重懸的 T 細(xì)胞顯微鏡下顯示圓形、分散、透亮，在 CD3 和 IL-的作用下，T 細(xì)胞抱團(tuán)生長，逐漸增多，5-7 天后，出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)，T 細(xì)胞呈圓形集簇、色深（圖 2），此時(shí)的細(xì)胞可收集用于轉(zhuǎn)染。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文出凍存管，快速放入 37 度水浴鍋中確保在 1min 內(nèi)解凍細(xì)胞懸液。吸出細(xì)胞懸液，緩慢滴入已經(jīng)準(zhǔn)備好的離心管中，離心 1000rx5min。③棄上清，加 IPSC 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照凍存管上標(biāo)記的密度接種于 MEF 上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 培養(yǎng) PBMC。利用 Ficoll 液分離臍血后得到的第二層白膜層即為 T 細(xì)胞層，呈“云霧狀”，界線肉眼可見（圖 1）。初重懸的 T 細(xì)胞顯微鏡下顯示圓形、分散、透亮，在 CD3 和 IL-的作用下，T 細(xì)胞抱團(tuán)生長，逐漸增多，5-7 天后，出現(xiàn)較多細(xì)胞團(tuán)，T 細(xì)胞呈圓形集簇、色深（圖 2），此時(shí)的細(xì)胞可收集用于轉(zhuǎn)染。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文在 SeV 轉(zhuǎn)染后 10-15 天，六孔板中逐漸出現(xiàn)多個(gè)小的細(xì)胞團(tuán)，即為 IPS 細(xì)胞團(tuán)，團(tuán)內(nèi)細(xì)胞核質(zhì)比較大，緊致而邊界清晰。細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)后再培養(yǎng) 1 周左右，細(xì)胞團(tuán)明顯增大，邊界仍清晰，呈扁平狀，此時(shí)可將充分展開的大的細(xì)胞團(tuán)（圖 3）挑至新的六孔板中培養(yǎng)。將六孔板置于顯微鏡下觀察，可見 IPSC 呈致密集落樣，集落飽滿，邊緣光滑（圖 4）。本研究中，我們每次轉(zhuǎn)染選取 1X105PBMC 轉(zhuǎn)染，獲得 20-40 個(gè)克隆，轉(zhuǎn)染效率 0.02-0.04%，效率較高。

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本文編號：2766635