【摘要】：目的:1.探討一種簡捷、易行且高效的體外分離、培養(yǎng)及鑒定子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的方法,并對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測以及表面標(biāo)志物鑒定。2.通過蘇木素-伊紅染色、免疫組織化學(xué)檢測及生育力評估等手段研究宮腔原位注射95%乙醇建立薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型的可行性,為薄型子宮內(nèi)膜的相關(guān)研究提供理想的動物模型。3.通過蘇木素-伊紅染色、免疫組織化學(xué)檢測及生育力評估等手段探討子宮內(nèi)膜干細(xì)胞宮腔原位移植對小鼠薄型子宮內(nèi)膜的作用,為薄型子宮內(nèi)膜的修復(fù)研究及臨床診治提供新思路。方法:1.選擇產(chǎn)后21d的雌性C57BL/6J小鼠作為提取子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的實驗動物,通過機械分離與兩步酶消法體外分離、培養(yǎng)C57BL/6J小鼠的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。分離、培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞,進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測,并采用CCK-8法測定細(xì)胞增殖曲線。流式細(xì)胞儀檢測子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD45、CD73、CD105及CD117的表達情況。2.選擇6~8周齡SPF級性成熟且未交配C57bl/6J雌性小鼠84只作為實驗動物,通過宮腔原位注射95%乙醇損傷子宮內(nèi)膜建立薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型。將84只實驗小鼠隨機分為兩大組,其中一組小鼠36只。于造模后第三個動情期將實驗小鼠頸椎脫臼處死,收集子宮樣本,觀察子宮形態(tài),進行HE染色、子宮內(nèi)膜厚度測量等;免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、血管內(nèi)皮生長因子和雌激素受體α的表達情況。另一組小鼠48只,又隨機分為空白組、對照組、單側(cè)損傷組和雙側(cè)損傷組,造模后所有存活小鼠于第三個動情期進行合籠交配,分析小鼠生育能力的情況,從功能方面評估薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型是否建立成功。3.選擇6~8周齡SPF級性成熟且未交配C57bl/6J雌性小鼠192只作為實驗動物。小鼠右側(cè)一側(cè)子宮通過宮腔注入95%乙醇建立單側(cè)薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型,小鼠左側(cè)一側(cè)子宮作為自身正常對照。將模型鼠隨機分為磷酸鹽緩沖溶液(PhosPhate buffered solution,PBS)注射3d對照組(模型鼠損傷側(cè)子宮給予PBS 0.1 mL,n=24);PBS注射7d組(損傷側(cè)子宮給予PBS 0.1 mL,n=24);PBS注射14d組(損傷側(cè)子宮給予PBS 0.1 mL,n=24);PBS注射30d組(損傷側(cè)子宮給予PBS 0.1 mL,n=24);子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植3d組(造模后,損傷側(cè)子宮立即宮腔原位移植子宮內(nèi)膜干細(xì)胞0.1 mL,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24);子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植7d組(造模后,損傷側(cè)子宮立即宮腔注射子宮內(nèi)膜干細(xì)胞0.1 mL,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24);子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植14d組(造模后,損傷側(cè)子宮立即宮腔注射子宮內(nèi)膜干細(xì)胞0.1 ml,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24);子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植30d組(造模后,損傷側(cè)子宮立即宮腔原位移植子宮內(nèi)膜干細(xì)胞0.1 ml,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24。分別于子宮內(nèi)膜干細(xì)胞/PBS移植后的第3、7、14和30天頸椎脫臼處死小鼠,固定子宮組織標(biāo)本,每組12只。HE染色觀察子宮內(nèi)膜組織狀態(tài),測量子宮內(nèi)膜厚度;免疫組化檢測子宮內(nèi)膜中角蛋白、波形蛋白、血管內(nèi)皮生長因子和雌激素受體α的表達以評估子宮內(nèi)膜細(xì)胞的再生情況;同時,每組其余小鼠于取樣的相應(yīng)時間點進行合籠交配,分析子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植對小鼠生育力的影響,從功能方面評估子宮內(nèi)膜干細(xì)胞對小鼠薄型子宮內(nèi)膜的作用。結(jié)果:1.通過機械分離與兩步酶消法獲得的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可貼壁生長,以梭形細(xì)胞為主,呈漩渦狀或輻射式生長。P1,P3子宮內(nèi)膜干細(xì)胞增殖曲線均呈S型,存在一定的滯留期、對數(shù)期和平臺期;經(jīng)凍存復(fù)蘇后的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的生長狀態(tài)正常;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD29、CD73和CD105均表達為陽性,CD45,CD117表達為陰性。2.HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗組部分小鼠的子宮出現(xiàn)了宮腔堵塞現(xiàn)象,并且實驗組小鼠子宮內(nèi)膜層明顯變薄,腺體數(shù)量減少,局部血管稀疏。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,實驗組小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、血管內(nèi)皮生長因子和雌激素受體α的表達均較空白組與對照組顯著降低。生育力評估實驗結(jié)果顯示合籠交配后,空白組和對照組小鼠正常受孕,雙側(cè)損傷實驗組小鼠未受孕,單側(cè)損傷實驗組損傷側(cè)子宮未受孕,未損傷側(cè)子宮正常受孕,且損傷側(cè)子宮的平均懷孕率較未損傷側(cè)顯著降低(P0.01),表明宮腔注入95%乙醇能夠損傷小鼠子宮內(nèi)膜,導(dǎo)致生育力降低。3.HE染色結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植后,子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植組較相應(yīng)PBS對照組的子宮內(nèi)膜水腫程度明顯減輕,狀態(tài)較好,宮腔粘連、堵塞情況顯著降低,且腺體、血管數(shù)量增多;子宮內(nèi)膜厚度明顯增厚,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,各子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植組細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、血管內(nèi)皮生長因子和雌激素受體α的平均光密度值明顯高于相應(yīng)PBS對照組(P0.05),且與其他治療組相比,子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植30d組各指標(biāo)的表達量差異具有顯著性(P0.01),但仍低于左側(cè)正常子宮對照組(P0.05)。生育力評估實驗結(jié)果顯示合籠交配后,各組左側(cè)正常子宮正常受孕,右側(cè)PBS 3d、7d和14d對照組子宮未受孕,且右側(cè)各子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植組子宮的平均懷孕率明顯高于PBS對照組;與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植3d和7d組相比,干細(xì)胞移植14d組右側(cè)子宮的懷孕率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而干細(xì)胞移植30d組差異具有顯著性(P0.01),表明子宮內(nèi)膜干細(xì)胞宮腔原位移植對小鼠薄型子宮內(nèi)膜有一定的修復(fù)作用,并可提高生育力。結(jié)論:1.通過機械分離與兩步酶消法分離、培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外增殖能力強,純度高,生長狀態(tài)佳,是獲得子宮內(nèi)膜干細(xì)胞簡便、有效的方法,且所獲細(xì)胞可作為相關(guān)研究的種子細(xì)胞。2.本研究建立了穩(wěn)定的薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型,該模型可用于薄型子宮內(nèi)膜病理機制及修復(fù)的相關(guān)研究。3.子宮內(nèi)膜干細(xì)胞經(jīng)宮腔原位移植于薄型子宮內(nèi)膜小鼠,可不同程度的增加子宮內(nèi)膜厚度,促進子宮內(nèi)膜細(xì)胞再生,修復(fù)子宮內(nèi)膜受損組織以及提高小鼠生育力,提示子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植對薄型子宮內(nèi)膜有一定的修復(fù)作用。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.74
【圖文】：

離心 5min；棄上清，加入 10mLPBS，1500rpm 離心 5min；棄上清液，加入 500μLPBS 重懸細(xì)胞，制成 1.0×106/ml 的細(xì)胞懸液，平均分成 5 管；每管按說明書分別加入不同量的特定抗體（抗 CD29-APC、抗 CD45、抗 CD73-FITC、抗 CD105-FITC、抗 CD117-FITC），4℃避光孵育 30min 后流式細(xì)胞儀檢測。2 結(jié) 果2.1 小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與傳代接種后于倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞量多，且主要是圓形細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。約 24h 后即可見少量貼壁細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)不一；3d 后觀察可見貼壁細(xì)胞明顯增多，多呈梭形；培養(yǎng) 4-5d 后可見貼壁細(xì)胞呈漩渦狀或輻射式生長；7-10d 后即可見細(xì)胞集落融合成片，鋪滿培養(yǎng)瓶底部（見圖 1-1）。

注：A：P3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)第 1 天；B：P3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)第 3 天；C：P3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)第 5 天圖 1-2 傳代后小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)2.2 小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇凍存的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞復(fù)蘇后，顯微鏡下觀察可見大量的圓形細(xì)胞。接種約 24h可見大部分的細(xì)胞已貼壁生長，多呈梭形。經(jīng)冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞生長較慢，約 12-14d才能長至鋪滿瓶底，但經(jīng)傳代后的細(xì)胞生長速度加快，約 6-7d 即可進行再次傳代（見圖 1-3）。

注：A：P3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)第 1 天；B：P3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)第 3 天；C：P3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)第 5 天圖 1-2 傳代后小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)2.2 小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇凍存的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞復(fù)蘇后，顯微鏡下觀察可見大量的圓形細(xì)胞。接種約 24h可見大部分的細(xì)胞已貼壁生長，多呈梭形。經(jīng)冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞生長較慢，約 12-14d才能長至鋪滿瓶底，但經(jīng)傳代后的細(xì)胞生長速度加快，約 6-7d 即可進行再次傳代（見圖 1-3）。

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