【摘要】：研究目的:盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)是以陰道分娩損傷、年齡增長(zhǎng)、結(jié)締組織老化或修復(fù)異常等多因素導(dǎo)致的盆底支持組織薄弱,引發(fā)盆腔器官(包括膀胱、子宮、陰道、直腸等)的位置和功能異常,不同程度地影響著患者的生活質(zhì)量。大量研究發(fā)現(xiàn),POP患者的盆底支持組織中總膠原蛋白含量明顯減少,盆底支持組織的膠原蛋白由成纖維細(xì)胞合成及分泌,主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白。目前Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的變化對(duì)POP患者的影響也得到廣泛關(guān)注。Ⅰ型膠原,與組織韌性有關(guān),直徑較大。相對(duì)于Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ),Ⅲ型膠原(collagenⅢ,ColⅢ)含量較少,與組織彈性有關(guān),而且直徑相對(duì)較小。Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比例的增加可以增加膠原纖維直徑并增加組織韌性;而Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的下降則會(huì)導(dǎo)致膠原纖維直徑變小,韌性下降,彈性增加。自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)的一種“自我吞噬”現(xiàn)象,是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程,并且能通過溶酶體途徑將細(xì)胞內(nèi)受損、衰老或者變性的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器進(jìn)行消化降解。大量的文獻(xiàn)表明,POP患者中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的數(shù)量減少,但造成膠原蛋白減少的機(jī)制卻仍不清楚,那么膠原蛋白的減少和自噬的清除功能是否存在相關(guān)性,相關(guān)性如何,能否通過調(diào)控細(xì)胞的自噬活性增加膠原蛋白的數(shù)量,從而延緩POP患者的發(fā)生呢?為了探索上述假設(shè),本論文以POP患者與非POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,先檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白(LC3、Beclin1)及膠原蛋白的表達(dá),再利用饑餓誘導(dǎo)自噬和自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬后檢測(cè)細(xì)胞自噬活性與膠原蛋白表達(dá)量的變化,對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行初步探索。研究方法:1.選取2017年6月-2018年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科接受手術(shù)治療的POP患者及非POP患者的陰道壁組織,各10例,用膠原蛋白酶消化法對(duì)陰道壁成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),并對(duì)其進(jìn)行鑒定。2.POP患者與非POP患者均取第4-10代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的陰道壁成纖維細(xì)胞,各組予10%胎牛血清、1%青鏈霉素的含糖DMEM/F12培養(yǎng)液正常培養(yǎng)5天,蛋白印跡(Western blotting)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(LC3和Beclin1)、膠原蛋白(ColⅠ和ColⅢ)的表達(dá)。3.透射電鏡下觀察POP患者陰道壁成纖維細(xì)胞中自噬體數(shù)量的變化。4.將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的POP患者與非POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞,隨機(jī)分成對(duì)照組(含糖含血清DMEM/F12培養(yǎng)液)和饑餓處理組(無糖無血清DMEM/F12培養(yǎng)液),培養(yǎng)4小時(shí)后,蛋白印跡檢測(cè)LC3和Beclin1的表達(dá)。5.將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的POP患者與非POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞,隨機(jī)分成對(duì)照組(含糖含血清DMEM/F12培養(yǎng)液)、饑餓處理組(無糖無血清DMEM/F12培養(yǎng)液)和3-MA處理組(含糖含血清DMEM/F12培養(yǎng)液+10mmol/L 3-MA),培養(yǎng)4小時(shí)后,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative Polymerase chain reaction,RT q-PCR)檢測(cè)LC3、Beclin1、ColⅠ和ColⅢ在m RNA水平的表達(dá),蛋白印跡檢測(cè)LC3、Beclin1、ColⅠ和ColⅢ在蛋白水平的表達(dá)。研究結(jié)果:1.陰道壁組織于培養(yǎng)接種第3-5天可見細(xì)胞貼壁散在生長(zhǎng),分布不均的單個(gè)貼壁細(xì)胞呈梭形,邊界清楚,待細(xì)胞培養(yǎng)第10-12天時(shí),可見生長(zhǎng)已達(dá)80%-90%的梭形貼壁細(xì)胞,呈魚群樣或漩渦狀排列。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定第二代成纖維細(xì)胞,抗波形蛋白染色陽性,抗角蛋白染色陰性,同時(shí)結(jié)合相應(yīng)標(biāo)本部位,證實(shí)為陰道壁成纖維細(xì)胞。2.在含糖含血清DMEM/F12培養(yǎng)液的正常培養(yǎng)下,POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中與非POP患者相比較,LC3、Beclin1、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.透射電鏡結(jié)果顯示,POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中,饑餓處理組較對(duì)照組自噬體數(shù)量增多;3-MA處理組較對(duì)照組自噬體數(shù)量減少。4.饑餓處理后,POP患者與非POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II蛋白表達(dá)量分別為(0.808±0.015)、(0.901±0.059),Beclin1的蛋白表達(dá)量分別為(0.750±0.049)、(0.980±0.044),表達(dá)水平上升,提示細(xì)胞自噬水平增加。5.POP患者與非POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中,與對(duì)照組相比較,饑餓處理組LC3和Beclin1在m RNA水平的表達(dá)均上升,3-MA處理組LC3和Beclin1在m RNA水平的表達(dá)均下降。6.POP患者與非POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中,與對(duì)照組相比較,3-MA處理組LC3蛋白表達(dá)量分別為(0.349±0.015)、(0.464±0.055),Beclin1的蛋白表達(dá)量分別為(0.140±0.049)、(0.340±0.036),表達(dá)均下降,提示3-MA作用下自噬水平下降。7.POP患者陰道壁成纖維細(xì)胞中,與對(duì)照組相比較,饑餓處理組和3-MA處理組Col I和Col Ⅲ在m RNA和蛋白水平的表達(dá)均呈下降,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但非POP患者饑餓組誘導(dǎo)自噬后,相較于對(duì)照組,Col I和Col Ⅲ在m RNA和蛋白水平的表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論:1.POP患者與非POP患者陰道壁成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)成功。2.POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白和膠原蛋白的表達(dá)低于非POP患者。3.饑餓誘導(dǎo)與3-MA藥物均通過大自噬途徑調(diào)節(jié)自噬水平,POP患者膠原蛋白的減少可能與其他自噬途徑相關(guān)。4.非POP患者陰道壁成纖維細(xì)胞中自噬增強(qiáng)后膠原表達(dá)下降,推測(cè)未脫垂患者在自噬增強(qiáng)的影響下患POP風(fēng)險(xiǎn)可能性增高。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R711.2
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.陰道壁成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察每日置顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)，如圖1所示，原代的陰道壁成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)接種第3-5天可見細(xì)胞貼壁散在、分布不均生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈梭形，邊界清楚，如圖2所示，待細(xì)胞培養(yǎng)第10-12天時(shí)，可見生長(zhǎng)已達(dá)80％-90％的梭形貼壁細(xì)胞,呈魚群樣或漩渦狀排列。圖 1 陰道壁成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)第 3 天(10×)圖 2 陰道壁成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)第 10 天(10×)2.陰道壁成纖維細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色波形蛋白和角蛋白分別存在于中胚層細(xì)胞、上皮及上皮來源的細(xì)胞漿內(nèi)，并且通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕色染色時(shí)，即為陽性結(jié)果。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定第二代的陰道壁成纖維細(xì)胞，抗波形蛋白染色

每日置顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)，如圖1所示，原代的陰道壁成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)接種第3-5天可見細(xì)胞貼壁散在、分布不均生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈梭形，邊界清楚，如圖2所示，待細(xì)胞培養(yǎng)第10-12天時(shí)，可見生長(zhǎng)已達(dá)80％-90％的梭形貼壁細(xì)胞,呈魚群樣或漩渦狀排列。圖 1 陰道壁成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)第 3 天(10×)圖 2 陰道壁成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)第 10 天(10×)2.陰道壁成纖維細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色波形蛋白和角蛋白分別存在于中胚層細(xì)胞、上皮及上皮來源的細(xì)胞漿內(nèi)，并且通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕色染色時(shí)，即為陽性結(jié)果。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定第二代的陰道壁成纖維細(xì)胞，抗波形蛋白染色

29陽性，并且抗角蛋白染色陰性，與標(biāo)本取材部位相結(jié)合，證實(shí)是陰道壁成纖維細(xì)胞。（如圖3、圖4所示）圖 3 陰道壁成纖維細(xì)胞抗角蛋白染色陰性（10×）圖 4 陰道壁成纖維細(xì)胞抗波形蛋白染色陽性（10×）3.驗(yàn)證檢測(cè)POP患者與非POP患者陰道壁成纖維細(xì)胞中自噬及膠原的蛋白表達(dá)如圖5、表1所示，在含糖含血清DMEM/F12培養(yǎng)液的正常培養(yǎng)下， POP患者的陰道壁成纖維細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II、Beclin1的表達(dá)低于非POP患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 孫智晶,郎景和,朱蘭,陳杰;膠原狀態(tài)與壓力性尿失禁的病因?qū)W研究[J];中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志;2004年01期

本文編號(hào)：2760267