【摘要】：目的:子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Carcinoma,EC)是女性常見的惡性腫瘤之一,合并肥胖、糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)、高血壓皆是高危險族群,近幾年發(fā)病率呈逐年上升,并且發(fā)病人群越來越年輕化。臨床上,主要的治療方法是手術(shù)切除,但治療后復(fù)發(fā)率和死亡率仍較高、預(yù)后差。臨床實踐中發(fā)現(xiàn),EC患者中DM是普遍存在的伴發(fā)疾病,長期高血糖狀態(tài)增加EC的發(fā)生和發(fā)展危險。LncRNA(long non-coding RNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,在多種腫瘤中異常表達(dá),通過多種機制調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展,被證實為惡性腫瘤形成的重要的基因表達(dá)調(diào)控器。長鏈非編碼RNA生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄物5(LncRNA Growth arrest-specific transcript 5,LncRNA GAS5)在乳腺癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤中低表達(dá),過表達(dá)GAS5可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、阻滯細(xì)胞周期,目前關(guān)于GAS5在DM合并EC中的研究并不多,因此本研究探討GAS5在DM促進(jìn)EC發(fā)展過程中的作用及機制。方法:1、根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測影響EC生存期的指標(biāo),收集并統(tǒng)計天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院2017年5月-2018年2月新發(fā)的EC患者的病歷資料,將所有EC患者依據(jù)是否合并DM分為單純EC組和DM合并EC組,對兩組患者的臨床病理特點比較,采用qRT-PCR檢測兩組癌組織中GAS5和miR-222-3p的表達(dá),同時分析其與臨床病理特點的關(guān)系和各指標(biāo)之間的關(guān)系。2、體外培養(yǎng)EC細(xì)胞株HEC-1A和Ishikawa,采用不同濃度的葡萄糖(5.5mM、15mM、20mM、25mM),干預(yù)EC細(xì)胞48h,利用qRT-PCR檢測GAS5和miR-222-3p的表達(dá)變化,構(gòu)建GAS5過表達(dá)載體,和miR-222-3p抑制劑,應(yīng)用CCK-8實驗、克隆形成及Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞增殖、克隆形成及侵襲作用。3、在不同高糖濃度下,采用qRT-PCR檢測P27的表達(dá),利用核質(zhì)分離試劑盒檢測GAS5在Ishikawa細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,使用雙熒光素酶實驗驗證GAS5和miR-222-3p及miR-222-3p和P27(CDKN1B)的關(guān)系;過表達(dá)GAS5和上調(diào)miR-222-3p共同轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞后,檢測miR-222-3p和P27表達(dá)的變化,使用Western blot檢測P27蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:1、利用生物信息學(xué),挑選出與EC相關(guān)的LncRNA GAS5進(jìn)行研究,與高表達(dá)GAS5的EC患者相比,低表達(dá)GAS5的EC患者遠(yuǎn)期預(yù)后差,生存期縮短(P=0.072)。臨床資料分析,DM合并EC組的患者初診時,腫瘤FIGO分期和組織分級都高于單純EC組,且更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.05)。在EC組織中GAS5呈低表達(dá),且下降程度與是否合并DM、腫瘤組織分級、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。與單純EC組相比,DM合并EC組的癌組織中GAS5的表達(dá)量更低(P0.05);與癌旁正常子宮內(nèi)膜相比,EC合并與不合并DM患者miR-222-3p的表達(dá)均升高,且DM合并EC組的患者miR-222-3p的表達(dá)升高更多,其上升程度與腫瘤FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05),兩組中GAS5與miR-222-3p之間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P0.05)。2、與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞相比,HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞中,GAS5的表達(dá)水平明顯下調(diào),而miR-222-3p的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P0.01)。隨著高糖濃度的增加,GAS5的表達(dá)呈下降趨勢,而miR-222-3p的表達(dá)呈上升趨勢(P0.05)。過表達(dá)GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)EC細(xì)胞系內(nèi),并穩(wěn)定表達(dá);體外細(xì)胞生物學(xué)行為研究發(fā)現(xiàn),高糖(25mM)能夠促進(jìn)EC細(xì)胞增殖、增強克隆形成和侵襲能力,而過表達(dá)GAS5或者抑制miR-222-3p后都可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的EC細(xì)胞的增殖、克隆形成及侵襲(P0.01)。3、在HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞中,P27的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P0.01),隨著高糖濃度的增加,P27的表達(dá)呈下降趨勢(P0.05)。在Ishikawa細(xì)胞中GAS5在細(xì)胞漿的表達(dá)量高于細(xì)胞核;雙熒光素酶實驗結(jié)果提示GAS5與miR-222-3p存在結(jié)合位點,兩者能直接調(diào)控,而P27(CDKN1B)可以與miR-222-3p結(jié)合。與對照組相比,過表達(dá)GAS5后,miR-222-3p的表達(dá)量下降,P27的表達(dá)水平上升(P0.01);上調(diào)miR-222-3p后,P27 mRNA和蛋白水平均下調(diào);而過表達(dá)GAS5同時上調(diào)miR-222-3p后,P27 mRNA和蛋白水平出現(xiàn)了明顯減少(P0.01)。結(jié)論:1、DM可能會通過影響EC的分期分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、影響患者的預(yù)后,LncRNA GAS5可能作為EC患者的一個預(yù)后指標(biāo)。2、GAS5和miR-222-3p可能在DM合并EC中起著重要作用,過表達(dá)GAS5或抑制miR-222-3p后,可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的EC細(xì)胞的增殖、克隆形成及侵襲能力。3、高糖經(jīng)LncRNA GAS5/miR-222-3p通過調(diào)控P27影響EC細(xì)胞增殖和侵襲。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33
【圖文】：

圖 1 高表達(dá)/低表達(dá) GAS5 對子宮內(nèi)膜癌患者的生存影響.2 DM 組和 NDM 組子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理參數(shù)比較共有 36 例子宮內(nèi)膜癌患者被納入本次研究，其中單純子宮內(nèi)膜癌患者，合并糖尿病患者 9 例。中位年齡 52.5 歲（53.1±9.22 歲，32-70 歲）；重指數(shù) 25.8kg/m2（25.4±2.35kg/m2，20.4-29.1kg/m2）；其中糖尿病合并膜癌患者中位年齡 50.0 歲（49.1±7.43 歲，36-60 歲），中位體重指數(shù) 26.3k26.2±1.62kg/m2，23.1-28.4kg/m2），單純子宮內(nèi)膜癌患者中位年齡 54.0 歲（

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文注：*P＜0.05，**P＜0.011.2.3 DM 組和 NDM 組子宮內(nèi)膜癌患者組織的形態(tài)學(xué)特點兩組癌旁組織中子宮內(nèi)膜的腺體輪廓平滑、無增生，腺上皮細(xì)胞的頂緣光滑、平整，不具有異型性。DM 組子宮內(nèi)膜癌組織的腺體實性生長明顯，腺上皮細(xì)胞多為呈簇狀突入腔內(nèi)，復(fù)層或多層，細(xì)胞大小不一，核圓形、橢圓形、卵圓形、不規(guī)則形，核仁清晰，染色質(zhì)粗顆粒狀，部分細(xì)胞核空亮，核分裂易見。NDM 組子宮內(nèi)膜癌組織中增生的腺體形成復(fù)雜的糾纏的管道，輪廓不規(guī)則，腺上皮細(xì)胞呈放射狀襯在極細(xì)的質(zhì)網(wǎng)架上，間質(zhì)減少，具有腺上皮細(xì)胞異型性，細(xì)胞核增大、變圓、不規(guī)則、失去極向，核仁明顯，胞漿豐富嗜酸性。（見圖 2）

NCECDMDM+EC012345****NDM組 DM組 CTvalue(mir-222expression)圖 4 miR-222-3p 在 DM 組和 NDM 組子宮內(nèi)膜癌患者組織中的相對表達(dá)量注：DM 組中 DM+EC 為癌組織，DM 為癌旁組織；NDM 組中 EC 為癌組織NC 為癌旁組織。*P＜0.05，**P＜0.01

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本文編號：2759650