【摘要】：背景卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤,由于傳統(tǒng)的卵巢癌治療方法效果不佳,因此尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)卵巢癌的治療具有重要意義。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)信號(hào)通路在細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前研究報(bào)道在卵巢癌中檢測(cè)出STAT3信號(hào)通路異�；罨�,并且降低STAT3水平可以抑制卵巢癌的生長(zhǎng)和遷移。因此對(duì)卵巢癌中STAT3信號(hào)通路的研究具有十分重要的意義。法尼酯衍生物X受體(FXR)是一種膽汁酸核受體,對(duì)機(jī)體的多種生理功能起到調(diào)控作用。子宮內(nèi)膜異位癥是卵巢癌的一種發(fā)病原因,研究報(bào)道FXR可以通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)通路來(lái)作用子宮內(nèi)膜異位癥。但關(guān)于FXR在卵巢癌中的作用目前還未見(jiàn)報(bào)道,因此在本論文中我們針對(duì)FXR在卵巢癌細(xì)胞中的作用及其具體機(jī)制展開(kāi)研究。目的本篇論文通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示FXR對(duì)卵巢組織和人卵巢癌細(xì)胞的作用,以及具體分子機(jī)制。方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn):模型Ⅰ:選取9-10周齡的FXR基因敲除(FXR KO)雌性小鼠和C57BL/6J野生型雌性小鼠,確保發(fā)育完全并采用無(wú)激素飼料喂養(yǎng),避免交配產(chǎn)生個(gè)體差異。收集血清樣本,提取卵巢組織中的RNA和組織蛋白,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)探究FXR敲除對(duì)于小鼠卵巢和體內(nèi)雌激素水平的具體影響。模型Ⅱ:選用高成瘤率的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3進(jìn)行異體腫瘤移植實(shí)驗(yàn),BALB/c裸鼠無(wú)胸腺,具有T細(xì)胞免疫缺陷。培養(yǎng)狀態(tài)良好的SKOV3細(xì)胞,將5×10~6個(gè)細(xì)胞重懸于150μL的PBS中,種植在裸鼠腋窩皮下,5天左右可見(jiàn)成瘤,之后隨機(jī)分組進(jìn)行腹腔給藥。實(shí)驗(yàn)組注射FXR激動(dòng)劑GW4064,GW4064溶解于DMSO(6 mg/mL),根據(jù)體重計(jì)算每只小鼠注射藥量為(30 mg/kg),對(duì)照組注射DMSO,使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小。兩天為一周期給藥,給藥同時(shí)測(cè)量瘤體大小,共給藥8個(gè)周期。最后一次給藥結(jié)束后處死裸鼠,取出瘤體,并對(duì)瘤體進(jìn)行Ki67的免疫組化染色,評(píng)估瘤體增殖程度。異體腫瘤移植實(shí)驗(yàn)探究腹腔注射FXR激動(dòng)劑對(duì)移植卵巢癌腫瘤的影響。體外實(shí)驗(yàn):表型實(shí)驗(yàn):本課題所用到的細(xì)胞系為人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3與OVCAR8,實(shí)驗(yàn)組加入GW4064進(jìn)行處理,對(duì)照組加入DMSO。首先進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),SKOV3細(xì)胞使用1μM和2μM的GW4064進(jìn)行處理,OVCAR8的藥物濃度為0.5μM和1μM。通過(guò)記錄激動(dòng)劑處理后不同時(shí)間點(diǎn)的OD值來(lái)探究FXR激動(dòng)劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響;其次進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和MTT實(shí)驗(yàn)相同,記錄不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞劃痕愈合程度,探究FXR激動(dòng)劑對(duì)于卵巢癌細(xì)胞遷移的影響;最后使用GW4064處理SKOV3細(xì)胞48 h,并回收包括死細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞,進(jìn)行Annexin-V-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FXR激動(dòng)劑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。機(jī)制研究:依據(jù)表型實(shí)驗(yàn)選取適宜的藥物濃度進(jìn)行進(jìn)一步的分子機(jī)理研究。SKOV3細(xì)胞使用2μM的GW4064進(jìn)行處理,OVCAR8使用的藥物濃度為1μM。首先,使用GW4064處理卵巢癌細(xì)胞24 h,提取細(xì)胞的RNA,并測(cè)量相關(guān)的炎癥基因和凋亡基因,探索FXR激動(dòng)劑對(duì)于人卵巢癌細(xì)胞基因水平的調(diào)控;其次,使用GW4064處理卵巢癌細(xì)胞24 h,并使用人IL-6(10 ng/mL)處理6 h以激活STAT3信號(hào)通路。提取細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)p-STAT3(Tyr705)水平的變化,以確定GW4064對(duì)卵巢癌細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的影響,探究FXR激動(dòng)劑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的調(diào)控。反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):購(gòu)買(mǎi)FXR的小干擾RNA,轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞,測(cè)量FXR的mRNA水平,選用干擾效果最明顯的siRNA,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果1、在FXR KO小鼠的卵巢組織中,IL-2、IL-4、INF-γ等炎癥基因的表達(dá)水平高于野生型小鼠;并且p-STAT3(Tyr705)蛋白的表達(dá)水平也高于野生型小鼠;FXR KO小鼠血清中雌二醇水平低于野生型小鼠(P0.05)。2、在體外成瘤模型中,實(shí)驗(yàn)組小鼠腋下腫瘤組織的生長(zhǎng)速率、腫瘤體積和增殖指標(biāo)明顯低于對(duì)照組(P0.05)。3、表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,激活FXR可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移,并且能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡(P0.05)。4、FXR激活后能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中的炎癥基因Cox-2、MMP2、IL-6、IL-4、MCP-1的表達(dá)(P0.05),并上調(diào)促凋亡基因p53、p21、p27(P0.05)、Caspase3、c-Myc、Bax(P0.01)的表達(dá);在蛋白水平上,能抑制IL-6誘導(dǎo)的p-STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化(P0.05)。5、FXR的siRNA干擾FXR表達(dá)的同時(shí)可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(P0.05)。結(jié)論1、FXR基因敲除后小鼠卵巢組織STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化和部分炎癥因子的mRNA水平上調(diào),血清雌二醇水平下降。2、FXR激動(dòng)劑GW4064通過(guò)抑制人卵巢癌細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路來(lái)負(fù)向調(diào)控炎癥因子的表達(dá),并上調(diào)促凋亡基因的mRNA水平,從而引起卵巢癌細(xì)胞的凋亡,并抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移。3、FXR激動(dòng)劑GW4064能夠通過(guò)腹腔吸收來(lái)抑制異體移植卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.31
【圖文】：

圖 3-1 FXR KO 上調(diào)小鼠卵巢部分炎癥基因，促進(jìn) STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化，并下調(diào)血清雌二醇水平圖 3-1，F(xiàn)XR 的缺失可以上調(diào)小鼠卵巢的部分炎癥基因，促進(jìn) STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化，并下調(diào)血清雌二醇水平。（A）為 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠卵巢組織 IL-2、IL-4、INFγ 基因的 mRNA 水平，提示 FXR KO 小鼠卵巢組織部分炎癥基因相對(duì)于野生型 WT小鼠出現(xiàn)上調(diào)。（B）為 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠每只個(gè)體卵巢組織的蛋白灰度條帶，提示 FXR KO 小鼠個(gè)體的卵巢組織中 STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化水平普遍高于 WT 組。（C）為不同基因型小鼠卵巢組織組內(nèi)融合蛋白的灰度條帶，提示融合相同基因型小鼠卵巢組織蛋白，總體來(lái)看 FXR KO 上調(diào)了 STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化。灰度分析使用每個(gè)樣品的 p-STAT3(Tyr705)蛋白灰度除以各自對(duì)應(yīng)的總 STAT3 蛋白灰度，得出圖 C 中的柱狀圖（。D）為 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠組內(nèi)血清雌二醇水平的平均值，提示 FXR KO小鼠的血清雌二醇水平水平低于 WT 小鼠。（*：P<0.05，n=5）

圖 3-1 FXR KO 上調(diào)小鼠卵巢部分炎癥基因，促進(jìn) STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化，并下調(diào)血清雌二醇水平圖 3-1，F(xiàn)XR 的缺失可以上調(diào)小鼠卵巢的部分炎癥基因，促進(jìn) STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化，并下調(diào)血清雌二醇水平。（A）為 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠卵巢組織 IL-2、IL-4、INFγ 基因的 mRNA 水平，提示 FXR KO 小鼠卵巢組織部分炎癥基因相對(duì)于野生型 WT小鼠出現(xiàn)上調(diào)。（B）為 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠每只個(gè)體卵巢組織的蛋白灰度條帶，提示 FXR KO 小鼠個(gè)體的卵巢組織中 STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化水平普遍高于 WT 組。（C）為不同基因型小鼠卵巢組織組內(nèi)融合蛋白的灰度條帶，提示融合相同基因型小鼠卵巢組織蛋白，總體來(lái)看 FXR KO 上調(diào)了 STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化�；叶确治鍪褂妹總�(gè)樣品的 p-STAT3(Tyr705)蛋白灰度除以各自對(duì)應(yīng)的總 STAT3 蛋白灰度，得出圖 C 中的柱狀圖（。D）為 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠組內(nèi)血清雌二醇水平的平均值，提示 FXR KO小鼠的血清雌二醇水平水平低于 WT 小鼠。（*：P<0.05，n=5）

圖 3-2 FXR 激動(dòng)劑 GW4064 抑制異體移植卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)圖 3-2，GW4064 抑制異體移植腫瘤的生長(zhǎng)，并降低腫瘤的增殖程度。（A）為 次給藥結(jié)束后整體狀況，可見(jiàn) GW4064 處理組腫瘤體積小于對(duì)照組，兩組裸鼠明顯差異。（B）為完整剝離出的腫瘤情況，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積小于對(duì)照組。藥同時(shí)測(cè)量的腫瘤體積，結(jié)果可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)速度低于對(duì)照組。（D）為光下腫瘤組織免疫組化 Ki67 的結(jié)果（a、b 放大倍數(shù)為 400 倍），實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織率要低于對(duì)照組，提示實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織的增殖程度低于對(duì)照組。每個(gè)樣品在光下各取 20 個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì) Ki67 陽(yáng)性率，并求取平均值。（*：P<0.05，n=5由體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得知，F(xiàn)XR 基因敲除可以上調(diào)小鼠卵巢組織部分炎癥基因的表T3(Tyr705)蛋白的磷酸化水平，并且 FXR KO 降低小鼠血清雌二醇水平。GW

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本文編號(hào)：2759406