【摘要】：研究背景及目的:卵巢癌是死亡率最高且預(yù)后最差的最常見三大婦科腫瘤之一。由于早期缺乏特異的臨床癥狀及有效的檢測手段,大部分患者確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,而這其中有超過75%的進(jìn)展期患者會復(fù)發(fā)并且出現(xiàn)對化療藥物的耐藥性。大約有90%的進(jìn)展期患者死于多藥耐藥的發(fā)生。為了克服卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3的多藥耐藥性,我們利用RNAi技術(shù),LAH4-L1作為遞送載體將針對主要編碼P糖蛋白的siMDR1基因遞送至SKOV-3細(xì)胞內(nèi),使其耐藥基因MDR1沉默掉,逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的多藥耐藥性。通過自組裝方式形成LAH4-L1-siMDR1納米復(fù)合物(LSMCs)后我們對其物化表征、pH響應(yīng)性、細(xì)胞毒性等進(jìn)行了檢測;然后分別在基因及蛋白水平上檢測了轉(zhuǎn)染以后目的基因MDR1的沉默效率及相關(guān)蛋白P-gp的表達(dá)情況;采用基因聯(lián)用化療藥物的方式檢測SKOV-3細(xì)胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)情況;最后我們檢測了轉(zhuǎn)染以后對細(xì)胞周期以及遷移能力的影響。研究方法:1.LSCMs物化表征的檢測(電位、粒徑、形貌、siRNA包載能力、pH響應(yīng)性);2.LSCMs對SKOV-3細(xì)胞內(nèi)MDR1基因沉默效率的檢測(基因水平、蛋白水平);3.CCK8實(shí)驗(yàn)(LSCMs毒性實(shí)驗(yàn)、耐藥性逆轉(zhuǎn)程度檢測實(shí)驗(yàn));4.細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)及其機(jī)制實(shí)驗(yàn);5.溶酶體逃逸及其機(jī)制實(shí)驗(yàn);6.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn);7.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn);8.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果:1.LSCMs(L/siMDR1=3/1)是一個帶有弱正電荷的、粒徑小于200nm的類圓形納米顆粒,能夠很好地將siMDR1包載起來并且具有pH響應(yīng)性;2.通過RT-PCR對MDR1基因水平的檢測可以看出LSCMs轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞的最佳質(zhì)量比3/1,能夠?qū)崿F(xiàn)87.3%的MDR1的基因沉默,85%的P糖蛋白的表達(dá)下調(diào);3.LSCMs(L/siMDR1=3/1)具有較低的細(xì)胞毒性,且通過基因轉(zhuǎn)染與化療藥物聯(lián)用的方式能夠使細(xì)胞凋亡率從裸露siMDR1組的20.7%(PTX=3μg/ml)、27.9%(PTX=7.5μg/ml)、39.7%(PTX=15μg/ml)升至LSMCs轉(zhuǎn)染組的52.5%(PTX=3μg/ml)、60.8%(PTX=7.5μg/ml)、73.7%(PTX=15μg/ml)。與阿霉素DOX聯(lián)用時,細(xì)胞凋亡率從裸露組的38.4%(5μg/ml)和41%(10μg/ml)增至LSMCs組的50.6%(5μg/ml)和82.9%(10μg/ml);4.LSCs(L/Cy5-si=3/1)組的內(nèi)吞過程基本上在1h之內(nèi)完成,且是經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的膜穴樣凹陷及其他一些未知的途徑進(jìn)入SKOV-3細(xì)胞內(nèi)的,并且該過程是能量依賴型的;5.LSCs(L/Cy5-si=3/1)能夠在6h時完成SKOV-3細(xì)胞內(nèi)的溶酶體逃逸過程,且質(zhì)子化作用是LSCs成功逃離溶酶體的重要機(jī)制之一;6.經(jīng)LSMCs(L/siMDR1=3/1)沉默MDR1基因以后的細(xì)胞遷移能力較未轉(zhuǎn)染組降低了約50%,較裸露siMDR1轉(zhuǎn)染組降低了約25%。Transwell實(shí)驗(yàn)的遷移細(xì)胞數(shù)從未轉(zhuǎn)染組的722個減少至LSCs轉(zhuǎn)染組的312個;7.通過基因轉(zhuǎn)染聯(lián)用化療藥物紫杉醇的方式檢測了耐藥性的逆轉(zhuǎn)情況。細(xì)胞凋亡數(shù)從裸露siMDR1組的9.07%增至LSMCs(L/siMDR1=3/1)轉(zhuǎn)染組的53.2%,未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡數(shù)僅為7.81%;8.LSMCs(L/siMDR1=3/1)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以引起S期的增加,MDR1基因沉默以后聯(lián)用紫杉醇可以引起細(xì)胞S期和G2期的同時增加。結(jié)論:用LAH4-L1-siMDR1納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV-3能夠?qū)崿F(xiàn)較高的沉默效率,逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性的同時還能夠降低細(xì)胞的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文我們利用正負(fù)電荷相互作用的自組裝方式制備了 LAH4-L1-siMDR通過復(fù)合物轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞株 SKOV-3，轉(zhuǎn)染以后細(xì)胞內(nèi) MD沉默效率、P 糖蛋白的表達(dá)量降低程度以及通過基因轉(zhuǎn)染聯(lián)用化療測 MDR1 基因沉默以后卵巢癌耐藥細(xì)胞株 SKOV-3 的耐藥性逆轉(zhuǎn)程所關(guān)注的重點(diǎn)。除此以外，我們還檢測了復(fù)合物的物化表征（電位NA 包載能力、pH 響應(yīng)性）、攝取及其機(jī)制、溶酶體逃逸及其機(jī)制、周期及遷移能力的變化。劇 ATCC 官網(wǎng)上記載，SKOV-3 細(xì)胞是從腹水中提取出來的，對腫瘤壞死因子等多種細(xì)胞毒性藥物耐藥。圖的概括總覽圖。

圖 2：不同實(shí)驗(yàn)條件是轉(zhuǎn)染效率的影響Figure 2：Effect of different conditions on transfection efficiency3.1.2 LSCs 與商業(yè)試劑、PAMAM 以及 PEI 遞送效率的比較（Hela-GFP cell）如圖我們可以看出 LSC（sL/siGFP=5/1）的沉默效率均大于商業(yè)試劑、PAMAM以及 PEI 的。所有對比試劑的沉默效率均是按照說明書，選擇其最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下檢測所得。

圖 2：不同實(shí)驗(yàn)條件是轉(zhuǎn)染效率的影響Figure 2：Effect of different conditions on transfection efficiency3.1.2 LSCs 與商業(yè)試劑、PAMAM 以及 PEI 遞送效率的比較（Hela-GFP cell）如圖我們可以看出 LSC（sL/siGFP=5/1）的沉默效率均大于商業(yè)試劑、PAMAM以及 PEI 的。所有對比試劑的沉默效率均是按照說明書，選擇其最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下檢測所得。

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