【摘要】：研究背景與目的宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤,每年新發(fā)病例約13萬,占世界總發(fā)病數(shù)28%,每年約2萬女性死于宮頸癌。宮頸癌最主要的病原學原因是人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染。而只有一小部分女性感染高危型HPV將發(fā)展癌前病變,即宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宮頸癌。HPV主要的致病原因是E6、E7癌基因整合至宿主DNA內(nèi),導致p53和pRB兩個抑癌基因失活。然而,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中,僅HPV感染并不足以引起宮頸癌,基因的異常調(diào)控、細胞的異常代謝、基因組的不穩(wěn)定性等同樣發(fā)揮重要作用。自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的II型程序性細胞死亡,細胞在應激情況下,如缺氧、生長因子水平改變、暴露于細胞毒性環(huán)境,自噬會被上調(diào)。自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用具有兩面性,一方面,自噬可以作為腫瘤抑制因子抑制腫瘤的發(fā)生,另一方面,自噬可以促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。自噬相關(guān)蛋白ATG12是ATG12基因編碼的一種蛋白。在哺乳動物細胞中ATG12與ATG5形成復合物,在自噬的形成中發(fā)揮至關(guān)的重要。研究表明,自噬相關(guān)蛋白,如Beclinl,參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。然而ATG12在宮頸癌及癌前病變中的作用尚不明確。本研究的目的:(1)檢測ATG12在正常宮頸上皮、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及宮頸癌組織中的表達及臨床意義;(2)探索ATG12在預測宮頸錐切術(shù)后病變復發(fā)的價值;(3)在細胞分子水平探索ATG12的調(diào)控機制。第一部分自噬相關(guān)蛋白ATG12在宮頸病變組織中的表達及臨床意義目的本研究的目的是檢測ATG12在正常宮頸上皮、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織及宮頸癌組織中的表達及臨床意義。材料與方法組織標本來源于2010年至2015年期間于萊蕪市婦幼保健院確診為宮頸癌并接受手術(shù)治療(子宮切除或根治性子宮切除)后宮頸癌組織;行診斷性或治療性宮頸錐切術(shù)或診斷為CIN行子宮切除術(shù)的宮頸病變組織;因婦科良性疾病(子宮肌瘤、子宮肌腺癥)行子宮切除術(shù)的組織。利用免疫組織化學的方法檢測ATG12在宮頸鱗癌標本、CIN1標本、CIN2-3標本、正常宮頸組織標本中的表達。統(tǒng)計分析兩組之間率的比較采用Fisher確切概率法,采用Bonferroni方法來調(diào)整每個檢驗的檢驗水準,進行多組間樣本率的兩兩比較,調(diào)整檢驗水準后p0.008(0.05/6=0.008)為有統(tǒng)計學差異。研究結(jié)果共收集120例宮頸組織標本,進行了免疫組織化學染色(細胞漿著色為陽性,不著色為陰性)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATG12主要表達在細胞漿,在30例正常宮頸組織中,28例陽性,陽性率為93.3%,30例CIN1組織中27例陽性,陽性率為90.0%,30例CIN2-3組織中16例陽性,陽性率為53.3%,30例宮頸鱗癌組織中僅7例陽性,23例陰性,陽性率為23.3%。CIN2-3和宮頸鱗癌組織ATG12陽性率均顯著低于正常組織和CIN1組,正常組織和CIN1組無差異,CIN2-3和宮頸鱗癌無差異。小結(jié)我們的實驗首次研究了 ATG12在宮頸癌及癌前病變中的差異表達,發(fā)現(xiàn)ATG12在CIN2-3和宮頸鱗癌中表達下降,提示ATG12參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,有望成為宮頸癌及HPV感染的治療靶點。第二部分ATG12與宮頸錐切術(shù)后病變復發(fā)的相關(guān)性研究目的通過回顧性病例對照研究,尋找與宮頸病變持續(xù)或復發(fā)相關(guān)的因素,探索自噬相關(guān)蛋白ATG12在宮頸錐切術(shù)后病變持續(xù)或復發(fā)中的臨床意義。材料與方法回顧性收集2009年1月至2015年12月于萊蕪市婦幼保健院行宮頸錐切術(shù)的352例患者的臨床病理特征及隨訪信息。術(shù)后3個月、6個月及12個月時復查TCT及HPV。此后,每6-12個月進行細胞學與HPV的聯(lián)合檢測。轉(zhuǎn)診陰道鏡的指征是ASCUS及更嚴重的病變或HPV持續(xù)陽性超過1年。病變持續(xù)的定義是錐切術(shù)后半年之內(nèi)活檢證實的高級別CIN,病變復發(fā)的定義是半年以上活檢證實的高級別CIN。以宮頸錐切術(shù)后病變殘留或復發(fā)患者作為病例組,以同期在我院接受宮頸錐切術(shù)并隨訪2年無復發(fā)患者為對照組,按照病例組:對照組=1:1的比例進行匹配。選取病變持續(xù)或復發(fā)患者的初次錐切術(shù)組織標本蠟塊及匹配組患者的初次宮頸錐切術(shù)的石蠟標本,采用免疫組化的方法檢測ATG12在兩組標本的表達。研究結(jié)果按照入選標準和排除標準進行篩選后,最終298名患者納入本研究中。中位隨訪時間25個月,最短12個月,最長64個月。在隨訪期間共72人次轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查。陰道鏡暴露充分者共37例,占51.39%;暴露不充分者35例,占48.61%。61人次接受陰道鏡下宮頸活檢術(shù)�；顧z病理證實,共28例患者病理為CIN2-3,診斷為病變持續(xù)或復發(fā)。按照28例復發(fā)組為病例組,配對的28例未復發(fā)病例為對照組,比較兩組的年齡、術(shù)后3個月HPV、宮頸錐切術(shù)切緣、ATG12表達情況,結(jié)果表明兩組間年齡無差別。復發(fā)組HPV陽性率為89.3%(25/28),未復發(fā)組陽性率為35.7%(10/28),復發(fā)組HPV陽性率顯著高于未復發(fā)組(p0.001)。復發(fā)組ATG12表達陽性率為25%(7/28),未復發(fā)組ATG12表達陽性率為71.4%(20/28),未復發(fā)組ATG12表達陽性率顯著高于復發(fā)組(p=0.001)。手術(shù)切緣陽性率復發(fā)組為28.6%(8/28),未復發(fā)組為3.6%(1/28),復發(fā)組手術(shù)切緣陽性率顯著高于未復發(fā)組(p=0.025)。HPV陽性、ATG12表達的缺失和切緣陽性是宮頸病變錐切術(shù)后病變持續(xù)或復發(fā)的危險因素。HPV陽性的比值比(odds ratio,OR)= 15,95%可信區(qū)間(CI)=(3.7,61.1),ATG12表達缺失的OR值為7.5,95%CI(2.3,24.5),切緣陽性的 OR 值為 10.8,95%CI(1.2,93.4)。小結(jié)我們這項病例對照研究發(fā)現(xiàn),術(shù)后HPV陽性、切緣陽性和ATG12蛋白表達缺失是宮頸病變持續(xù)或復發(fā)的高危因素。ATG12是與細胞自噬相關(guān)的重要蛋白,不僅參與細胞的自噬,還與細胞的凋亡、炎癥反應等多個細胞活動有關(guān)。我們首次研究了 ATG12在宮頸病變隨訪中的作用。第三部分MiR-378通過調(diào)控ATG12促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲目的本部分的研究目的是探索ATG12的表觀調(diào)控機制,探索ATG12與miR-378的相互作用及對宮頸癌細胞的作用和臨床意義。材料與方法收集60例因良性婦科疾病行子宮切除術(shù)的正常子宮頸組織、70例CIN III組織及55例宮頸鱗癌組織標本。常規(guī)培養(yǎng)人子宮頸癌細胞系HeLa和C-33A細胞。利用TargetScan軟件預測調(diào)控ATG12的miRNA,初步預測ATG12是miR-378的靶基因。構(gòu)建小干擾RNA(si-ATG12)下調(diào)ATG12的表達;miR-378過表達慢病毒GIPZ-miR-378及mi R-378干擾病毒載體;實時熒光定量PCR檢測ATG12 mRNA及miR-378的相對表達量;Western blot檢測CCND1、磷酸化-Rb及ATG12蛋白的表達;雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-378對ATG12的調(diào)控作用。研究結(jié)果通過Targetscan預測ATG12的調(diào)控miRNA,結(jié)果顯示ATG12的3'UTR 449-455的位點與miR-378互補,熒光素酶報告分析結(jié)果顯示,在HeLa和C33-A細胞中,miR-378可以抑制pmirGLO-ATG12-3'-UTR野生型轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性,對pmirGLO-ATG12-3'-UTR突變型轉(zhuǎn)染細胞無影響,同時,miR-378陰性對照對pmirGLO-ATG12-3'-UTR野生型轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性無影響。表明,ATG12是miR-378直接靶基因,miR-378調(diào)控ATG12的表達。實時熒光定量PCR及Western Blot結(jié)果均顯示,siRNA-ATG12可以顯著抑制宮頸癌細胞系C-33A細胞ATG12的mRNA及蛋白的表達。Transwell小室模型實驗結(jié)果顯示,siRNA-ATG12組的侵襲和遷移能力顯著高于陰性對照組。干擾RNA si-ATG12組C-33A細胞的侵襲和遷移能力顯著高于對照組,提示ATG12可能抑制宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與正常宮頸組織相比,CIN3及宮頸鱗癌組織中miR-378的表達均顯著升高(p0.001),而CIN3組織與宮頸鱗癌組織中的表達無顯著差異。對宮頸鱗癌進一步分組分析發(fā)現(xiàn),伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的宮頸癌組織中miR-378的表達顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的宮頸癌組織(p0.05)。成功構(gòu)建miR-378的過表達和干擾慢病毒載體,miR-378過表達增強宮頸癌細胞系HeLa和C33-A細胞的體外遷移和侵襲能力,miR-378的下調(diào)抑制宮頸癌HeLa和C33-A細胞的遷移和侵襲能力。miR-378過表達的C-33A細胞中p-Rb、ATG12及CCND1蛋白的表達顯著下降。同樣,在miR-378 inhibitor組的HeLa細胞中,p-Rb、ATG12及CCNDI蛋白的表達顯著高于陰性對照組蛋白的表達,提示miR-378可能通過p-Rb、ATG12及CCND1蛋白促進宮頸癌細胞體外的轉(zhuǎn)移能力。小結(jié)ATG12是miR-378的功能靶標,miR-378促進宮頸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究的結(jié)果表明,ATG12及miR-378可能為宮頸癌患者的治療靶點,為宮頸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移分子機制提供新的理論。研究結(jié)論1、ATG12表達在大部分正常組織和CIN1中,ATG12在CIN2-3和宮頸鱗癌組織的陽性率顯著下降。2、ATG12表達的缺失,錐切術(shù)后HPV陽性和切緣陽性是宮頸錐切術(shù)后病變持續(xù)或復發(fā)的危險因素。3、ATG12是miR-378的功能靶標,miR-378可能通過調(diào)控ATG12促進宮頸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.33
【圖文】：

圖１ＡＴＧ１２在正常宮頸（Ａ），邋ＣＩＮ１邋（Ｂ）邋，ＣＩＮ２－３（Ｃ－Ｄ），宮頸鱗癌（Ｅ－Ｆ）中的表逡逑達逡逑

圖３通過Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ預測ＡＴＧ１２的表觀調(diào)控，結(jié)果顯示在ＡＴＧ１２的３’ＵＴＲ逡逑４４９－４５５的位點與ｍｉＲ－３７８互補。逡逑ＷＴ３．ＵＴＲ：邐５＇邋ＣＵＧＡＡＵＡＣＣＵＣＡＡＡＵＡＧＵＣＣＡＧＵ．逡逑ＩＩＩＩＩＩＩ逡逑ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８邐３＇邋ＡＡＧＡＣＧＧＡＧＧＵ－ＵＣＡＧＧＵＣＡ逡逑ＩＩＩＩＩＩＩ逡逑Ｍｕｔａｎｔ邐５＇邋．．．ＣＵＧＡＡＵＡＣＣＵＣＡＡＡＵＵＣＡＧＧＵＣＵ．．．逡逑圖４熒光素酶報告質(zhì)粒ｐｍｉｒＧＬＯ－ＡＴＧ１２－３’－ＵＴＲ野生型（ＷＴ）、突變型（ＭＵＴ）逡逑及ｍｉＲ－３７８互補序列逡逑Ｅ３邋產(chǎn)忙邐１２，邐＾３邋ＮＣ逡逑＞？邐＊１邋ＣＤ邋ｒｎＫ－３／８邐丁邐Ｉ邋１．１－邋Ｃ３邋ｒｒｉＲ－３７８邐丁逡逑Ｓ邐｜邋１０－邐ｆ＾ｉ邋Ｈ－ｉ逡逑Ｓ邋°Ａ＇邋ｍ邐ｋ邐Ｓ邐０．９－邐ｗ逡逑ｉ０邋７？W 邐■邐ｉ邐0：７－邐Ｈ逡逑⑶：W 邐＋邐Ｂ邐％邐0：６－邐Ｐ逡逑ｓｒ邋ｓ邋ｆｉ邋ｉ邐ｋ：媝？逡逑

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【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 薛鳳霞;劉宏圖;劉朝暉;;女性下生殖道人乳頭瘤病毒感染診治專家共識[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2015年10期

本文編號：2758997