【摘要】：研究背景輔助生殖技術(shù)(ART)顯著改善了不孕癥的治療和妊娠結(jié)局,然而不明原因的反復(fù)著床失敗(RIF)仍然是影響ART結(jié)局的主要問(wèn)題。其中子宮內(nèi)膜容受性低及母胎界面免疫異常是導(dǎo)致RIF的關(guān)鍵因素。巨噬細(xì)胞(Mφ)作為一種免疫吞噬細(xì)胞,在圍著床期子宮內(nèi)膜聚集,對(duì)于維持正常女性的生殖活動(dòng)必不可少。子宮內(nèi)膜容受性的建立需要Mφ分泌炎癥因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)分泌蛋白Dickkopf-3(DKK3)可影響炎性病灶中Mφ的募集,然而其在生殖生物學(xué)中的功能尚不明確。闡明DKK3對(duì)子宮內(nèi)膜Mφ的募集轉(zhuǎn)化作用,可為進(jìn)一步探究胚胎著床的分子機(jī)制及解決部分RIF患者的臨床問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)。研究目的探究子宮內(nèi)膜中DKK3的圍著床期和月經(jīng)周期性動(dòng)態(tài)表達(dá)情況以及DKK3對(duì)Mφ的募集和轉(zhuǎn)化作用。研究方法第一部分,設(shè)置妊娠小鼠第1、4、5、8天(D1、D4、D5、D8)作為實(shí)驗(yàn)組,未孕雌性小鼠作為對(duì)照組,收集相應(yīng)子宮標(biāo)本。同時(shí)收集行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者增殖中期及分泌中期子宮內(nèi)膜樣本。通過(guò)蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察子宮及子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué),然后通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)子宮內(nèi)膜中DKK3的表達(dá)量,以及F4/80和CD206分別標(biāo)記的M(φ數(shù)量。第二部分,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):(1)Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度DKK3對(duì)RAW264.7細(xì)胞遷移的作用;(2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度DKK3對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響;(3)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)分別檢測(cè)不同濃度及時(shí)間DKK3處理RAW264.7細(xì)胞后M1型及M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物及特異性可溶介質(zhì)的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選取雌性小鼠,向子宮角內(nèi)灌注濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的DKK3溶液作為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組注射等量PBS溶液,選擇3小時(shí)或8小時(shí)作為處死時(shí)間并收集小鼠子宮標(biāo)本。利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)子宮內(nèi)膜中F4/80和CD206分別標(biāo)記的Mφ數(shù)量。結(jié)果第一部分:(1)HE染色顯示小鼠受孕,受孕后子宮基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化;(2)小鼠子宮免疫組織化學(xué)染色顯示,DKK3在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)中的表達(dá)隨著妊娠天數(shù)增加而逐漸增加,并于D5達(dá)到頂峰。在蛻膜區(qū)域中,DKK3的表達(dá)較未分化的內(nèi)膜基質(zhì)區(qū)域減少,其中D8著床點(diǎn)周?chē)懩^(qū)域DKK3的表達(dá)高于非著床點(diǎn);(3)在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)中,F4/80標(biāo)記的Mφ數(shù)量及CD206標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著妊娠天數(shù)增加而逐漸增加,并分別于D4和D5達(dá)到頂峰。在蛻膜區(qū)域中Mφ及M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量均較未分化的內(nèi)膜基質(zhì)區(qū)域減少,但M2型巨噬細(xì)胞比例增高,其中D8著床點(diǎn)周?chē)懩^(qū)域M(φ及M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著高于非著床點(diǎn);(4)人子宮內(nèi)膜免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,分泌期子宮內(nèi)膜基質(zhì)中DKK3表達(dá)高于增殖期;(5)人子宮內(nèi)膜分泌期F4/80標(biāo)記的Mφ和CD206標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量均高于增殖期,M2型巨噬細(xì)胞比例也較增殖期增高;(6)Pearson相關(guān)性分析顯示子宮內(nèi)膜中DKK3的相對(duì)表達(dá)量與F4/80標(biāo)記的Mφ數(shù)量中等程度正相關(guān),而與CD206標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量強(qiáng)正相關(guān)。第二部分:(1)Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示DKK3能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞遷移;(2)MTT實(shí)驗(yàn)顯示DKK3對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖無(wú)影響;(3)qRT-PCR及Western Blot顯示DKK3處理RAW264.7細(xì)胞的劑量效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)對(duì)部分M1型及M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物或特異性可溶介質(zhì)的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量存在顯著影響;(4)小鼠子宮灌注實(shí)驗(yàn)中,HE染色顯示8小時(shí)處理組較3小時(shí)處理組子宮內(nèi)膜基質(zhì)水腫更為明顯,免疫組織化學(xué)染色顯示DKK3灌注液對(duì)RAW264.7細(xì)胞處理的時(shí)間效應(yīng)及劑量效應(yīng)對(duì)子宮內(nèi)膜F4/80標(biāo)記的M(φ數(shù)量以及M2型巨噬細(xì)胞比例均有影響。結(jié)論(1)子宮內(nèi)膜DKK3和Mφ在圍著床期和月經(jīng)周期不同時(shí)期的表達(dá)具有時(shí)空差異性;(2)DKK3能刺激M(φ的遷移并參與募集子宮內(nèi)膜Mφ;(3)DKK3可以誘導(dǎo)Mφ向M1或M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R714
【圖文】：

型子宮及與其相連的卵巢，將其取出。取出后無(wú)菌ＰＢＳ溶液漂洗凈表層血液，逡逑去除周?chē)窘M織后，小心分離子宮與卵巢組織，并將每側(cè)子宮分為３段。將逡逑組織塊放入４％多聚甲醛溶液并做好標(biāo)記，放入４°Ｃ冰箱中固定。圖片見(jiàn)圖１－１。逡逑９逡逑

以及其周?chē)|(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化和腺體數(shù)量減少。而在非植入部位腺體則相對(duì)逡逑密集。妊娠第八天（Ｄ８）胚胎已完全植入子宮內(nèi)膜中，可見(jiàn)植入對(duì)應(yīng)部位子宮逡逑增大并伴隨著更加廣泛的蛻膜化改變，腺體結(jié)構(gòu)基本消失。圖片見(jiàn)圖１－２。逡逑１４逡逑

逡逑的比值則顯著高于對(duì)照組（Ｐ＜０．０５）。圖片及圖表見(jiàn)圖１－４。逡逑Ａ邐ＣＷ邐0１邐Ｄ４邐Ｂ邐Ｆ４ｔ，°逡逑\：Ｕ廣逡逑■邋－：．邋：．：ｈ１１ｉ１邋－－ｉ，逡逑‘］邋，＿＿＝＿，逡逑}心．0出：邐二．．七銀Ｓ邋ｈｉW邋Ｔ々逡逑Ｄ５邋Ｓｔｒｏｍａ邐０５邋ＤＺ邐Ｄ８邋ＤＺ邐Ｏ邋２＂邐Ｈ邐ｄｉ邋Ｉ逡逑康；？身ｘ

本文編號(hào)：2757384