【摘要】：研究背景輔助生殖技術(ART)顯著改善了不孕癥的治療和妊娠結局,然而不明原因的反復著床失敗(RIF)仍然是影響ART結局的主要問題。其中子宮內(nèi)膜容受性低及母胎界面免疫異常是導致RIF的關鍵因素。巨噬細胞(Mφ)作為一種免疫吞噬細胞,在圍著床期子宮內(nèi)膜聚集,對于維持正常女性的生殖活動必不可少。子宮內(nèi)膜容受性的建立需要Mφ分泌炎癥因子介導炎癥反應。已有研究發(fā)現(xiàn)分泌蛋白Dickkopf-3(DKK3)可影響炎性病灶中Mφ的募集,然而其在生殖生物學中的功能尚不明確。闡明DKK3對子宮內(nèi)膜Mφ的募集轉化作用,可為進一步探究胚胎著床的分子機制及解決部分RIF患者的臨床問題提供理論基礎。研究目的探究子宮內(nèi)膜中DKK3的圍著床期和月經(jīng)周期性動態(tài)表達情況以及DKK3對Mφ的募集和轉化作用。研究方法第一部分,設置妊娠小鼠第1、4、5、8天(D1、D4、D5、D8)作為實驗組,未孕雌性小鼠作為對照組,收集相應子宮標本。同時收集行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者增殖中期及分泌中期子宮內(nèi)膜樣本。通過蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察子宮及子宮內(nèi)膜的形態(tài)學,然后通過免疫組織化學染色法檢測子宮內(nèi)膜中DKK3的表達量,以及F4/80和CD206分別標記的M(φ數(shù)量。第二部分,細胞實驗選取對數(shù)生長期RAW264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系)進行以下實驗:(1)Transwell小室細胞遷移實驗觀察不同濃度DKK3對RAW264.7細胞遷移的作用;(2)MTT實驗檢測不同濃度DKK3對RAW264.7細胞增殖的影響;(3)實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western Blot)分別檢測不同濃度及時間DKK3處理RAW264.7細胞后M1型及M2型巨噬細胞表面標志物及特異性可溶介質(zhì)的mRNA和蛋白的相對表達量。動物實驗選取雌性小鼠,向子宮角內(nèi)灌注濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml的DKK3溶液作為實驗組,對照組注射等量PBS溶液,選擇3小時或8小時作為處死時間并收集小鼠子宮標本。利用免疫組織化學染色法檢測子宮內(nèi)膜中F4/80和CD206分別標記的Mφ數(shù)量。結果第一部分:(1)HE染色顯示小鼠受孕,受孕后子宮基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化;(2)小鼠子宮免疫組織化學染色顯示,DKK3在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)中的表達隨著妊娠天數(shù)增加而逐漸增加,并于D5達到頂峰。在蛻膜區(qū)域中,DKK3的表達較未分化的內(nèi)膜基質(zhì)區(qū)域減少,其中D8著床點周圍蛻膜區(qū)域DKK3的表達高于非著床點;(3)在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)中,F4/80標記的Mφ數(shù)量及CD206標記的M2型巨噬細胞數(shù)量隨著妊娠天數(shù)增加而逐漸增加,并分別于D4和D5達到頂峰。在蛻膜區(qū)域中Mφ及M2型巨噬細胞數(shù)量均較未分化的內(nèi)膜基質(zhì)區(qū)域減少,但M2型巨噬細胞比例增高,其中D8著床點周圍蛻膜區(qū)域M(φ及M2型巨噬細胞數(shù)量均顯著高于非著床點;(4)人子宮內(nèi)膜免疫組織化學染色結果顯示,分泌期子宮內(nèi)膜基質(zhì)中DKK3表達高于增殖期;(5)人子宮內(nèi)膜分泌期F4/80標記的Mφ和CD206標記的M2型巨噬細胞的數(shù)量均高于增殖期,M2型巨噬細胞比例也較增殖期增高;(6)Pearson相關性分析顯示子宮內(nèi)膜中DKK3的相對表達量與F4/80標記的Mφ數(shù)量中等程度正相關,而與CD206標記的M2型巨噬細胞數(shù)量強正相關。第二部分:(1)Transwell小室細胞遷移實驗顯示DKK3能促進RAW264.7細胞遷移;(2)MTT實驗顯示DKK3對RAW264.7細胞增殖無影響;(3)qRT-PCR及Western Blot顯示DKK3處理RAW264.7細胞的劑量效應及時間效應對部分M1型及M2型巨噬細胞表面標志物或特異性可溶介質(zhì)的mRNA和蛋白的相對表達量存在顯著影響;(4)小鼠子宮灌注實驗中,HE染色顯示8小時處理組較3小時處理組子宮內(nèi)膜基質(zhì)水腫更為明顯,免疫組織化學染色顯示DKK3灌注液對RAW264.7細胞處理的時間效應及劑量效應對子宮內(nèi)膜F4/80標記的M(φ數(shù)量以及M2型巨噬細胞比例均有影響。結論(1)子宮內(nèi)膜DKK3和Mφ在圍著床期和月經(jīng)周期不同時期的表達具有時空差異性;(2)DKK3能刺激M(φ的遷移并參與募集子宮內(nèi)膜Mφ;(3)DKK3可以誘導Mφ向M1或M2型巨噬細胞轉化,可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714
【圖文】：

型子宮及與其相連的卵巢，將其取出。取出后無菌ＰＢＳ溶液漂洗凈表層血液，逡逑去除周圍脂肪組織后，小心分離子宮與卵巢組織，并將每側子宮分為３段。將逡逑組織塊放入４％多聚甲醛溶液并做好標記，放入４°Ｃ冰箱中固定。圖片見圖１－１。逡逑９逡逑

以及其周圍基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化和腺體數(shù)量減少。而在非植入部位腺體則相對逡逑密集。妊娠第八天（Ｄ８）胚胎已完全植入子宮內(nèi)膜中，可見植入對應部位子宮逡逑增大并伴隨著更加廣泛的蛻膜化改變，腺體結構基本消失。圖片見圖１－２。逡逑１４逡逑

逡逑的比值則顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５）。圖片及圖表見圖１－４。逡逑Ａ邐ＣＷ邐0１邐Ｄ４邐Ｂ邐Ｆ４ｔ，°逡逑\：Ｕ廣逡逑■邋－：．邋：．：ｈ１１ｉ１邋－－ｉ，逡逑‘］邋，＿＿＝＿，逡逑}心．0出：邐二．．七銀Ｓ邋ｈｉW邋Ｔ々逡逑Ｄ５邋Ｓｔｒｏｍａ邐０５邋ＤＺ邐Ｄ８邋ＤＺ邐Ｏ邋２＂邐Ｈ邐ｄｉ邋Ｉ逡逑康；？身ｘ

本文編號：2757384