【摘要】：宮腔粘連(IUA)是一種常見的獲得性子宮內(nèi)膜疾病,其主要繼發(fā)于子宮內(nèi)膜損傷(包括創(chuàng)傷、刮宮、感染、子宮先天性異常等)。近年來,隨著宮腔操作增多繼而加重的子宮內(nèi)膜損傷使得IUA的發(fā)病率呈快速增長的態(tài)勢,其已成為導(dǎo)致育齡期女性不育的最重要的原因之一。當(dāng)前,針對IUA的治療措施主要為宮腔鏡下分離粘連(transcervical resection of adhesion,TCRA),然后術(shù)后應(yīng)用雌激素、宮內(nèi)放置節(jié)育器防止粘連的再形成。然兒,對于重度IUA患者,TCRA后其子宮內(nèi)膜發(fā)生再粘連的概率仍然高達(dá)20%~62.5%,其妊娠成功率僅為22.5%~33.3%。因此,我們迫切需要開發(fā)治療IUA的替代方法。干細(xì)胞治療對于損傷疾病或病癥是一種有前景的方法。直至目前,科學(xué)家已經(jīng)在臨床前動物模型和臨床研究中探索了不同來源的干細(xì)胞治療子宮內(nèi)膜損傷的效果。然而,前期的研究中,移植干細(xì)胞的方式為子宮局部原位注射或者螺旋動脈推注。干細(xì)胞經(jīng)子宮局部原位注射后在內(nèi)膜損傷部位存活數(shù)量少,而經(jīng)螺旋動脈推注移植后募集效率低,使得治療后成功受孕率不理想。研究者采用不同的方法來克服移植干細(xì)胞存活率低的問題。他們發(fā)現(xiàn),一些生物材料(如聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)支架、水凝膠和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體)可以提高干細(xì)胞的存活率,從而改善干細(xì)胞治療的效果。有研究報道,膠原支架搭載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞和肌細(xì)胞的增殖,恢復(fù)子宮內(nèi)膜支持胚胎定植和成熟的能力。然而,經(jīng)上述方法移植后的干細(xì)胞存活率仍然有限。此外,膠原蛋白作為一種生物源性生物材料,其可重復(fù)性較差,存在引起超敏反應(yīng)、傳播疾病和免疫原性反應(yīng)的潛在風(fēng)險。聚癸二酸甘油(PGS)是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(尤其是軟組織再生領(lǐng)域)合成生物彈性體。其具有良好的彈性,使其在動態(tài)機(jī)械環(huán)境下能夠很好地維持和恢復(fù)軟組織的各種變形,而不會對周圍組織產(chǎn)生機(jī)械性刺激。同時,干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜損傷中的修復(fù)作用和其治療機(jī)制仍不清楚。本課題中,我們比較了PGS支架、PLGA支架、膠原支架搭載BMSCs和局部原位注射移植治療大鼠子宮內(nèi)膜損傷的效果。我們的研究結(jié)果表明,PGS支架提供的3D結(jié)構(gòu)有利于大鼠BMSCs的附著和生長。小動物活體成像結(jié)果顯示,與局部原位注射BMSCs和PLGA支架、膠原支架搭載移植相比,PGS支架搭載移植明顯延長了大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型中BMSCs的滯留時間。我們還發(fā)現(xiàn),PGS支架搭載移植組的子宮內(nèi)膜組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的表達(dá)水平顯著高于局部原位注射移植組和PLGA支架、膠原支架搭載移植組。此外,PGS支架搭載BMSCs移植較局部原位注射和PLGA支架、膠原支架搭載移植更能促進(jìn)損傷子宮內(nèi)膜的形態(tài)恢復(fù)。妊娠功能測試結(jié)果顯示,PGS支架搭載BMSCs移植組的子宮受孕率(73.6±1.1%)顯著地高于膠原支架搭載移植組(54.7±1.6%)和PLGA支架搭載移植組的受孕率(42.3±1.4%)。綜上,PGS支架搭載BMSCs移植可能是預(yù)防IUA的一種有前景方法。目前認(rèn)為,干細(xì)胞修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷的可能機(jī)制包括:(1)通過產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子和生長因子抑制局部炎癥損害;(2)通過自分泌和旁分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜損傷部位血管生成。然而,我們對于非編碼基因在干細(xì)胞促進(jìn)子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的機(jī)制還不了解。外泌體(exosome)是一種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),含有細(xì)胞特異性蛋白、脂質(zhì)和核酸,介導(dǎo)細(xì)胞間信號分子傳遞從而影響細(xì)胞功能的一種小囊泡,其在很多病理、生理過程中(如免疫抗原呈遞、腫瘤生長與遷移、組織損傷修復(fù)等)起著極其重要的作用。在本論文研究中,我們發(fā)現(xiàn),BMSCs治療后,大鼠機(jī)械性損傷子宮內(nèi)膜中microRNA 340(miR-340)水平顯著升高。然后,我們應(yīng)用過表達(dá)或敲減的方法上調(diào)或下調(diào)BMSCs細(xì)胞及其相應(yīng)外泌體中miR-340的表達(dá)來檢測外泌體是否介導(dǎo)了BMSCs與子宮內(nèi)膜實質(zhì)細(xì)胞之間的miR-340傳遞。我們發(fā)現(xiàn),與對照組相比,來源于過表達(dá)miR-340 BMSCs(miR-340~+BMSCs)或正常BMSCs的外泌體處理可以顯著地上調(diào)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESCs)中miR-340的表達(dá)水平,而來源于敲減miR-340 BMSCs(miR-340~-BMSCs)的外泌體無此效應(yīng)。接著,我們進(jìn)一步使用外泌體抑制劑GW4869驗證了外泌體介導(dǎo)了BMSCs與ESCs間miR-340的傳遞過程。在體內(nèi),我們采用紅色熒光標(biāo)記外泌體的方法證明,來源于BMSCs的外泌體可以轉(zhuǎn)移到鄰近的ESCs中。與對照組相比,BMSCs治療可以顯著地促進(jìn)損傷子宮內(nèi)膜的功能恢復(fù)和抑制其膠原蛋白1α1(Collagen1α1)、α-SMA和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的表達(dá)。miR-340~+BMSCs治療可以顯著地增強(qiáng)BMSCs治療的效果,而miR-340~-BMSCs顯著地減弱了BMSCs的治療效果。體外實驗結(jié)果表明,來源于BMSCs外泌體的miR-340可以抑制ESCs中TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過外泌體將miR-340傳遞給ESCs來發(fā)揮其的抗纖維化作用。因此,增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體相關(guān)的miR-340傳遞可能是預(yù)防子宮內(nèi)膜粘連的一種有前景的方法。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.74
【圖文】：

我們根據(jù)之前文獻(xiàn)所述的癸二酸和甘油的酯化反應(yīng)合成PGS[33]，其平均分子量為 24.3 kDa，多分散性指數(shù)為 1.30。然后，通過鹽浸出方法合成 PGS 多孔支架，其孔隙度為 90.6±0.7%。掃描電鏡（SEM）結(jié)果顯示，整個 PGS 多孔支架內(nèi)分布著大量互聯(lián)的孔隙，孔徑大小為（75 - 150μm）（圖1-1A，B）。此外，在大孔壁上還出現(xiàn)了一些微孔（幾微米）。這種分層多孔結(jié)構(gòu)使有效的質(zhì)量交換和細(xì)胞通信成為可能。差示掃描量熱法（DSC）結(jié)果表明，PGS 支架的 Tg 為 33.1℃以及其兩個熔點(diǎn)為 9.7℃和 24.8℃（圖 1-1 B），這表明化學(xué)交聯(lián)的 PGS 支架是無定型的，在體溫下可能具有彈性。我們采用壓縮試驗研究了 PGS 支架、PLGA 支架、膠原支架、子宮組織的力學(xué)性能。實驗結(jié)果顯示，PGS 多孔支架的模量（2.61±0.07 kPa）與大鼠子宮組織（2.71±0.17 kPa）相近，而 PLGA 支架的模量（21.53±2.30 kPa）和膠原支架的模量（63.91±5.94kPa）顯著大于大鼠子宮組織的模量（圖 1-1C）。循環(huán)壓縮試驗表明，與 PLGA和膠原支架相比，PGS 支架在動態(tài)變形下具有更好的彈性和疲勞耐久性，且有一定的滯后效應(yīng)（圖 1-1 D-F）。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定Figure1-2.BMSCsidentification(A)ThemorphologicalcharacteristicsoftheBMSCsatthethirddayundertheopticalmicroscope.(B I)DetectingthesurfacemarkersinratBMSCsbyflowcytometry.

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文表明，PGS支架搭載BMSCs移植組的BMSCs保留量高于局部原位注射組、PLGA支架搭載 BMSCs 組和膠原支架搭載 BMSCs 組（圖 1-3 L-O）。這表明，PGS 支架搭載 BMSCs 移植比 BMSCs 局部原位注射、PLGA 支架搭載 BMSCs 和膠原支架搭載 BMSCs 具有更強(qiáng)的延長 BMSCs 滯留子宮腔內(nèi)時間的能力。移植后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的長時間存留有利于受損子宮內(nèi)膜的修復(fù)。

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本文編號：2756466