【摘要】：背景與目的多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性較常見一種生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病,臨床癥狀主要為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng),排卵異常,卵巢多囊樣改變,高雄激素血癥,肥胖以及胰島素抵抗,并伴有較多遠期并發(fā)癥,如糖尿病,高血壓,高血脂,心血管疾病等,嚴重危害女性的身心健康。目前,關(guān)于PCOS的發(fā)病機制尚不明確,研究表明PCOS的發(fā)病與遺傳,環(huán)境,種族,生活方式以及慢性低度炎性反應(yīng)均有關(guān)系,探索PCOS可能的發(fā)病機制并尋找一種治療PCOS,延緩遠期并發(fā)癥的有效方法,已經(jīng)成為目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。microRNA(miRNA)是一種短鏈非編碼RNA,可在翻譯前水平調(diào)控基因的表達。miRNA參與各種生命活動,調(diào)控細胞的增殖凋亡,其表達水平異�？稍斐蓹C體生活活動的紊亂,導(dǎo)致癌癥,免疫性,內(nèi)分泌性等疾病的發(fā)生。研究表明,miRNA可能與胰島素抵抗的發(fā)生,卵泡發(fā)育障礙,顆粒細胞增殖凋亡以及卵泡激素的合成有關(guān),在PCOS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用。近期,外泌體已經(jīng)成為一個新的研究熱點,關(guān)于外泌體的研究越來越多。外泌體是由細胞通過胞吞胞吐作用分泌的一種直徑在30-100nm的膜性小囊泡,有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),鏡下呈杯口狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含miRNA,mRNA,lncRNA,脂質(zhì),蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì),廣泛分布于血清,血漿,卵泡液,腹水,唾液,尿液等多種體液中。外泌體作為一種新興的細胞間溝通媒介,可以通過將蛋白質(zhì),miRNA,mRNA等分子物質(zhì)傳遞到靶細胞中而在細胞通訊中發(fā)揮重要的作用。所以,目前關(guān)于外泌體源性miRNA作用的研究已經(jīng)成為一個新的方向,探索外泌體源性miRNA在各種疾病發(fā)生發(fā)展中可能分子機制。本實驗將從多囊卵巢綜合征患者血清,卵泡液外泌體miRNA出發(fā),通過高通量測序以及生物信息學(xué)分析,篩選出PCOS患者差異性表達的血清外泌體源性miRNA,為PCOS的診斷以及發(fā)病機制的研究提供一定的理論基礎(chǔ);同時篩選出PCOS患者差異性表達的卵泡液外泌體源性miRNAs及卵泡液特異性外泌體miRNAs,為探索PCOS患者胚胎質(zhì)量下降、排卵異常的分子機制提供一定的基礎(chǔ)。材料和方法選擇于河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的患者,根據(jù)鹿特丹標準診斷為PCOS的患者為實驗組,因單純輸卵管因素不孕的患者為對照組,經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準,患者簽署知情同意書后,選擇半年內(nèi)未進行激素治療的患者于月經(jīng)第2-4天抽取外周血,同時收取入組患者取卵當日的外周血及第一管清亮無血液污染的卵泡液。將收取的標本3000 rpm離心20 min,取上清液,分裝后凍于-80℃冰箱中備用。隨后,利用Exoquick ~(TM)試劑盒提取血清及卵泡液中的外泌體,透射電子顯微鏡觀測提取物的大小和形態(tài),Western-Blot檢測外泌體特異性蛋白標志物CD63和CD9的表達;采用試劑盒提取純化外泌體miRNAs,高通量測序和生物信息學(xué)分析PCOS組和正常組血清及卵泡液外泌體中miRNAs的差異性表達,實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Real Time qPCR,qRT-PCR)對10種篩選出的miRNAs進行驗證。采用SPSS22.0軟件錄入數(shù)據(jù)后進行t檢驗分析,實驗數(shù)據(jù)中的計量資料以x±s(均數(shù)±標準差)表示,P0.05為兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.經(jīng)透射電鏡和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)于血清和卵泡液中分離出的提取物符合文獻中對外泌體形態(tài)及特征的描述;2.高通量測序及生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:月經(jīng)D2-4外周血血清外泌體樣本中,PCOS組共有243條差異表達顯著的miRNAs,其中表達上調(diào)115條,下調(diào)128條;q-PCR驗證結(jié)果顯示miR-146a-5p,25-5p,27a-3p,93-5p,23a-3p,223-5p,25-3p,483-5p,383-5p的表達水平在PCOS組顯著升高(P0.05);而miR-141-3p的表達水平較正常組雖有下降,但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3.PCOS卵泡液外泌體中差異表達倍數(shù)在2倍以上且兩組均顯示“Detected”的miRNAs共有68條,表達上調(diào)27條,下調(diào)41條,篩選10條進行qRT-PCR驗證,結(jié)果顯示10種miRNAs的表達水平在PCOS患者中均較對照組顯著升高(P0.05);4.將卵泡液測序結(jié)果與取卵當天血樣測序結(jié)果對比分析,發(fā)現(xiàn)僅在卵泡液中表達的差異性表達miRNAs,共有63條,其中表達上調(diào)30條,下調(diào)33條。結(jié)論1.與NON-PCOS相比,PCOS月經(jīng)期血清中存在差異性表達miRNA,miR-146a-5p,93-5p,27a-3p,-23a,483-5p可能通過調(diào)控胰島素信號通路及顆粒細胞的增殖凋亡參與PCOS的發(fā)生發(fā)展。2.PCOS卵泡液外泌體中miR-16-5p,15b,486-5p可能與PCOS患者排卵障礙以及PCOS胰島素抵抗的形成有關(guān)。在PCOS中存在卵泡液特異性表達外泌體miRNA。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.75
【圖文】：

結(jié) 果清及卵泡液中外泌體的特性分析透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩組血清和卵泡液外泌體的形態(tài)及大�。▓D 1）為 30-250 nm 的圓形或橢圓形膜性囊泡，有雙層膜性結(jié)構(gòu)，可單個分群聚集分布，兩組之間形態(tài)與大小無明顯差異；SDS-PAGE 電泳后經(jīng)染色劑染色后顯示兩組電泳結(jié)果中蛋白條帶相似（圖 2），Wester行 CD9，CD63 的鑒定，檢測出兩組患者血清和卵泡液外泌體中均有63 的表達，而細胞中無這兩種蛋白（圖 3，圖 4）。

圖 2 考馬斯亮藍染色檢測血清外泌體蛋白成分 圖 3 Western blot 檢測外泌體標志分圖 4 CD9，CD63 特異性蛋白分子在兩組卵泡液外泌體中的表達2 PCOS 血清外泌體差異性表達 miRNAs 的生物信息學(xué)分析比對常見的 RNA 序列，檢測出樣品中的非編碼 small RNA，通過與已知RNA 數(shù)據(jù)庫比對鑒定小 RNA，分析出各類小 RNA 的所占比例，其中 miRN

圖 2 考馬斯亮藍染色檢測血清外泌體蛋白成分 圖 3 Western blot 檢測外泌體標志分圖 4 CD9，CD63 特異性蛋白分子在兩組卵泡液外泌體中的表達2 PCOS 血清外泌體差異性表達 miRNAs 的生物信息學(xué)分析比對常見的 RNA 序列，檢測出樣品中的非編碼 small RNA，通過與已知RNA 數(shù)據(jù)庫比對鑒定小 RNA，分析出各類小 RNA 的所占比例，其中 miRN

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本文編號：2752025